| 研究課題/領域番号 |
21K06598
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| 研究機関 | 福島県立医科大学 |
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研究代表者 |
小椋 正人 福島県立医科大学, 医学部, 講師 (10548978)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 活性酸素種 / ミトコンドリア / プロテオーム / アポトーシス / シグナル伝達 / アストロサイト / 神経変性疾患 / 質量分析 |
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| 研究実績の概要 |
酸化的リン酸化によるエネルギー産生はミトコンドリアの最も重要な機能であるが、同時に、ミトコンドリアはROSの主な発生源である。代謝に伴うROS発生については、神経変性疾患をはじめとする種々の加齢性疾患の発症要因の一つとされている。申請者はこれまでミトコンドリアc-Srcによる呼吸鎖複合体IIのsuccinate dehydrogenase A (SDHA)サブユニットの215番目のチロシンリン酸化がROS産生の抑制に必須の役割を持つことを見出してきた。さらに、アストロサイト群特異的に代謝性ROSの増加を示すSDHAY215Fリン酸化部位変異体発現トランスジェニック（Tg）マウスを作出し、運動協調性の低下、黒質におけるグリア線維性酸性タンパク質（GFAP）およびA1マーカーC3陽性細胞数の増加とチロシン水酸化酵素（TH）陽性神経細胞の減少を引き起こすことを見出した。本研究では、代謝性ROSに起因する反応性アストロサイトによるドパミン神経損傷メカニズムの解明を目的として、アストロサイト由来新規分泌因子の同定および機能解析を行った。CCL20やTinagl1等の複数のアストロサイト由来分泌因子を同定した。それらの分子をクローニングした後、アストロサイトにおいて過剰発現実験を行った。その培養上清およびリコンビナントタンパク質は、初代培養神経細胞死を誘導した。一方、p21-activated kinase 2 (PAK2)をターゲットとするsiRNAを用いた発現抑制実験では、神経細胞死を抑制した。以上の結果よりアストロサイトにおけるこれらの分泌因子発現およびPAK2活性化がドパミン神経細胞死に関わる可能性が示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
CAT-SDHAY215F発現Tgマウスとアルデヒド脱水素酵素1L1（Aldh1l1）プロモーターを持つCre発現マウスを交配させアストロサイト群特異的SDHAY215F変異体発現Tgマウスを作出した。研究実施計画に従い、研究目的であるアストロサイト群特異的SDHAY215F変異体発現Tgマウスの解析により同定した疾患候補分子（CCL20およびTinagl1）の機能解析を行った。それぞれの遺伝子をクローニングし、発現ベクターおよび発現レンチウイルスベクターに組込み、発現用システムを構築した。一方、リコンビナントタンパク質を大腸菌を用いて精製した。さらに、PAK2遺伝子配列に特異的なsiRNAを設計し、発現抑制システムを構築した。疾患候補分子の過剰発現アストロサイトの培養上清およびリコンビナントタンパク質は、初代培養神経細胞死を惹起した。一方、PAK2のsiRNAを用いた発現抑制実験により、そのアストロサイト培養上清の神経毒性は減弱化した。疾患候補分子の発現調節メカニズムを解析するために、プロモーター領域をクローニングし、レポーターベクターの作製を行った。この領域には、アストロサイト反応性に関わる複数の転写調節因子結合配列が見出された。
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| 今後の研究の推進方策 |
反応性アストロサイトに起因するドパミン神経細胞死メカニズムを明らかにする目的で、In vivo実験を中心に、ウイルス接種および行動解析を遂行する予定である。同定した神経細胞死を制御する新規アストログリア細胞分泌因子のin vivoにおける機能解析を行う。レンチウイルスおよびsiRNAシステムを使ってPAK2分子機能をin vivoで検証する。これらの研究から、ミトコンドリア活性酸素種により開始されるPAK2シグナル系の解明を通して、アストロサイト反応性と神経細胞死の分子メカニズムの全貌に迫り、神経変性疾患をはじめとする加齢性病態とミトコンドリア活性酸素種との関連性を考察する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
次年度の研究費は、当初の計画通りに、細胞培養培地類およびプラスチック器具（主にシャーレ）および動物の購入（ウイルス接種用）に使用する。これは、研究計画において同定した神経細胞死を制御する新規アストロサイト分泌因子および反応制御分子PAK2のin vivoにおける機能解析を行っていくためである。特にレンチウイルスの作製に関して高力価で純度の高いものを得るには、多大な細胞数から精製していく必要がある。さらに、遺伝子導入試薬の使用量も通常の実験よりも増加するため購入額が高めになる。そのほかに、疾患候補分子の抗体、シグナル伝達に関わる市販抗体および免疫沈降用ビーズ、siRNA作製の費用に、相当額の消耗品費を充当する必要性がある。また、本研究課題において得られた知見の迅速な公表を目的に、国内学会にて2回、および国際学会にて1回発表する予定である。そのため、研究費を国内および外国旅費に使用する。
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