| 研究課題/領域番号 |
21K06635
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| 研究機関 | 日本大学 |
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研究代表者 |
高宮 知子 日本大学, 薬学部, 講師 (50513917)
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| 研究分担者 |
遊川 知久 独立行政法人国立科学博物館, 植物研究部, グループ長 (50280524)
辻田 有紀 佐賀大学, 農学部, 准教授 (80522523)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | ラン科セッコク属植物 / 共生菌 / 成長促進 / 代謝物産生 |
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| 研究実績の概要 |
日本に自生するDendrobium offcinaleから、担子菌門ツラスネラ科に属する2種類の菌(TU22、TU27)、セレンディピタ科の1種類の菌(SE1)が単離された。この3種類の菌はD. officinaleの発芽を促進した。
次に、共培養の条件検討を行った。D. officinaleの完熟種子を無菌播種して培養した。約2か月培養した幼苗と単離した共生菌(TU22)の共培養を行った。培地は2.5 g/Lのオートミールを含む液体培地(OM)及び固体培地(OMA)を用いた。なお、培地には菌体接種、菌すり潰し液添加、菌培養液添加、菌抽出液添加などの処理を行い、共培養開始から2か月後に幼苗の成長を比較した。菌の成長が良好だった条件(OMAを用いて菌体を接種)で、3種類の共生菌(TU22、TU27、SE1)がD. officinaleに与える影響を検証した。共培養は菌ごとに実施し、培養開始から2週間毎に幼苗をサンプリングし、RNA抽出を行った。さらに、2か月間共培養した幼苗を凍結乾燥し、80%MeOHにてエキスを得た。次に、エキスの固相抽出を行いMeOH画分を得て、プロトンNMRフィンガープリントを用いたメタボローム解析を実施した。
それぞれの共生菌と2か月間共培養した幼苗の重量を比較した。TU22、TU27、SE1との共培養ではコントロール(菌の接種しない幼苗)と比較して、それぞれ25%、21%、39%増加した。次に根の成長を比較した。根の長さが2cm以上の幼苗の数は、コントロールと比較するとTU22では約1.5倍、TU27は約2倍、SE1では約1.1倍であった。根長の平均は、コントロールと比較すると、TU22、TU27、SE1との共培養では、13%、22%、4%増加した。今回の結果から、TU22、TU27、SE1は、D. officinaleの成長を促進することが示された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
今回、D. officinaleから単離された菌の中から、発芽及び成長を促進する3種類の菌を特定することができた。また、D. officinaleの幼苗からRNAを抽出する際に、既知の方法では解析に十分な量のRNAを得ることができなかったが、RNA抽出法の検討を行い、共培養を行った幼苗からでも十分な量及び品質のRNAを得ることが可能となった。遺伝子発現解析では、培養開始から2週間毎に幼苗をサンプリングして得られたRNAを用いて、ポリフェノール化合物の生合成に関わる遺伝子(ビベンジル合成酵素、カルコン合成酵素など)の発現をサンプル間で比較している。
代謝物のメタボローム解析に関しては、試料に用いる植物体の量、エキス抽出およびプロトンNMRの測定の条件検討を行い、試料間の代謝物の比較が可能となった。本法を用いてコントロール、TU22、TU27、SE1とそれぞれ共培養した幼苗の代謝物を比較したところ、TU22と共培養した幼苗では、3.4 ppm及び1.2 ppm付近のシグナル強度が高くなっていた。また、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いた分析も実施し、分析条件を定めた。
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| 今後の研究の推進方策 |
D. officinaleと同様に、日本に自生するD. moniliforme及びD. okinawenseと共生菌（TU22、TU27、SE1）をそれぞれ共培養し、各セッコク属植物に関して、共生菌が与える影響を菌ごとに明らかにする。遺伝子発現解析は、セッコク属植物のポリフェノール生合成の鍵酵素であるビベンジル合成酵素及びカルコン合成酵素、生合成経路においてこれらの酵素の上流・下流に位置するフェニルアラニンアンモニアリアーゼ、ケイ皮酸ヒドロキシラーゼなど、多数の遺伝子を対象に実施する。さらに、プロトンNMRを用いたメタボローム解析の結果から、共培養した幼苗では高磁場側のシグナルに変化が見られたことから、脂質代謝及び糖質の代謝に関与する生合成遺伝子に関しても発現解析を実施する。また、試料間の総脂質量、糖質量、総ポリフェノール量の測定を行い、それぞれの共生菌が影響を及ぼす代謝物群を特定する。さらに、選択的な大量培養系の構築を目指して、培養条件の検討を引き続き実施する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
予定していた学会及びミーティングがオンライン開催となり、旅費に計上していた予算を使用しなかった。また、コロナの影響で購入を予定していた物品が当該年度に購入できなかった。次年度は、遺伝子発現解析及びメタボローム解析の拡充に当てる。
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