| 研究課題/領域番号 |
21K06723
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| 研究機関 | 摂南大学 |
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研究代表者 |
倉本 展行 摂南大学, 薬学部, 教授 (60324092)
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| 研究分担者 |
宇野 恭介 摂南大学, 薬学部, 講師 (30608774)
金城 俊彦 摂南大学, 薬学部, 助教 (70758599)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | カリウム / ミトコンドリア / 脱分極 / 興奮性毒性 / 神経変性 / ホメオスタシス |
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| 研究実績の概要 |
Neuro2A細胞にはカリウム/クロライド共輸送体（KCC）2が発現していないことを確認した。この細胞に対してKCC2開口促進薬CLP257または同阻害薬VU 0240551を曝露しても、非曝露群と比較してMTT還元能は変化せず、これら薬物に細胞傷害作用が無いことを確認した。次に初代培養神経細胞におけるKCC2発現をPCRで確認した。この細胞に対してKCC2開口薬または阻害薬を曝露したが、非曝露群と比較してMTT還元能は変化しなかった。一方、VU 0240551を前処置しておくと初代培養神経細胞にバリノマイシンまたはサリチル酸曝露によるミトコンドリア脱分極の程度が減弱したが、NMDA曝露に伴う細胞死は抑制されなかった。簡易カリウムイオンセンサー（HORIBA）を用いて、培養液や培養細胞の破砕液及び組織破砕液のK+濃度を簡易に測定し、比較検討するする方法の確立を目指した。その結果、個々の細胞内のイオン濃度の定量は不可能で有ったが、薬物曝露有無などによるK+濃度の相対的な相違を定義することができることがわかった。例えば、Neuro2A細胞をK+を高濃度または低濃度含むまたはまったく含まない定義メディウム内でインキュベートした後、遠心した細胞をすりつぶし、K+濃度を測定すると、メディウム内の濃度依存的に細胞内K+濃度が変化することが確認できた。長期飼育（6月以上）マウスの飼育を開始した。予備実験として、5週齢、6月齢及び1年齢のマウス脳固定を実施し、KATPch構成サブユニットの一つ、SUR1の免疫化学染色法を行った。現在大きな相違は認められていない。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
2021年度もコロナ禍のため施設利用が困難な期間があり、研究推進に困難があった。特に人的資源の流動による遅れが大きい。すなわち、トレーニングされた学生が卒業したり、かわりの学生のトレーニングが遅れたりすることが致命的で有る。研究内容について、当初、曝露するだけで増殖能が変化すると想定していたKCC2開口薬または阻害薬に細胞増殖を変化させる作用、シナプス形成を変化させる作用あるいは生存能を変化させる作用があると期待されたが、現在の所、これらの効果が認められず、作用している事実の把握が困難である。一方で、現在、KCC2阻害薬事前曝露がミトコンドリア脱分極の程度を変化させる事実が確認できたことから、確かにKCC2は機能的に発現し、例えば阻害薬が作用していることが示され、この事実を足がかりとすることになる。ただし、阻害剤の効果は当初の想定、すなわち細胞死を誘発するあるいはNMDAの興奮性毒性を促進するなどとは異なり、KCC2開口薬または阻害薬事前曝露がNMDA曝露に伴う神経細胞死に対して影響を与えず、したがって細胞内カリウム濃度の定量が急務となった。したがって、簡易カリウムメータを用いた細胞内K+濃度測定条件の検討を開始し、研究時間が割かれた。培養細胞を用いたKCC2の開口促進または阻害による興奮性毒性に対する効果が明らかになるのが遅れているため、in vivo投与実験に進めていない。
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| 今後の研究の推進方策 |
ひきつづき初代培養神経細胞またはKCC2を発現している株細胞を用いて、KCC2開口薬及び阻害薬による細胞内K+濃度の変化の実態を把握する。その上で、興奮性毒性をNMDA曝露によって引き起こさせた場合への影響を検討する。また、前年度不十分だったKCC2開口薬CLP257曝露に伴うミトコンドリア脱分極への影響を検討する。簡易カリウムメータによる細胞内K+濃度の相対的変化の測定方法を用いて、各種の薬物曝露に伴う同濃度変化を測定、この方法が正しいことの裏付けを取るとともに、細胞内K+濃度を変化させる条件を明らかにする。明らかになれば、細胞内K+濃度増加条件がミトコンドリア脱分極の程度を高めるかどうかの検討を開始する。老齢マウスにおいて若年齢マウスに比べて、神経細胞内K+濃度調節する各種トランスポーター蛋白質の発現が変化しているかの検討を開始する。ただし以上は、KCC2開口薬、阻害薬はともに興奮性神経毒性に影響しない可能性を考慮し、既に検討してきたKATPチャネル開口薬及び阻害薬グリベンクラミドまたは新規にKCaの開口薬1-EBIO及び阻害薬アパミン曝露に伴う神経細胞生存への影響の検討を視野に入れて必要な準備を始める。例えば、KATPチャネル開口薬ミノキシジルによる神経保護効果の裏付けのため、構成蛋白質SUR1を発現する細胞、分布を明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
コロナ禍で研究進捗度が高くなく、やや残部を次年度に繰り越した。繰り越した助成金の額は小さく次年度の消耗品（特に抗体）に使用する予定である。その他、予定通り使用するよていである。
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