| 研究課題/領域番号 |
21K06819
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| 研究機関 | 浜松医科大学 |
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研究代表者 |
中島 光子 浜松医科大学, 医学部, 准教授 (20541965)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | ASTN1 / 脳形成障害 / ゲノムシークエンシング / Astn1ノックインマウス / iPS細胞 / AAVベクター |
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| 研究実績の概要 |
アストロタクチンは、ニューロン - アストログリア相互作用を媒介する脊椎動物特異的膜タンパク質であり、本タンパク質の障害がヒトの脳形成異常との関連が示唆されている。現在までに少数ではあるが、脳形成異常を呈する症例において両アレル性ASTN1バリアントが同定されており、本遺伝子の欠損が脳形成の異常をきたす可能性が示唆されている。昨年度の解析において、ゲノム編集技術(CRISPR/Cas9システム)を用いて作成したAstn１ノックインマウスの作成と尿中の上皮系細胞群から作成したiPS細胞の作成に成功している。本年度の研究では、Astn１ノックインマウスを用いて解析を行ったが、野生型と比較して成長・生存・脳構造および神経移動において有意な差は認められなかった。また、iPS細胞を用いて各種神経細胞への分化誘導実験を施行した。分化誘導では岡野ら(Matsumoto T. et al., Stem Cell Reports. 2016)の手法に基づき、iPS細胞を単細胞に分離後低酸素条件下で培養することによりNeurosphereを作成し、その後低分子化合物を添加することで各種神経系細胞への分化誘導を試みた。しかし、Neurosphereの形成を認めるものの以降の増殖が認められず、神経細胞の作成には至っていない。そのため、今後は培養条件の検討を行い、効果的に神経分化へ誘導できる条件を検索していく予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
ノックインマウスの解析では、有意な結果が得られかったことと、iPS細胞からの神経分化を試みたが、現時点では神経分化の成功には至っていないことがが原因として挙げられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
引き続きiPS細胞から神経への分化誘導実験を行い、モデル細胞の作成と機能解析を進めていく予定である。また、AAV血清型9を用いてモデル細胞への遺伝子補充を行う。AAVウイルス抽出にあたっては、今野らのminimal purification method(Konno A. and Hirai H. J Neurosci Methods. 2020)を用いることで、従来の手法と比較して迅速・簡便に高濃縮のAAVウイルス液を作成し、マウスを用いて神経細胞への良好な感染を確認している。同ウイルスに野生型疾患候補遺伝子の組み込みを行い、モデル細胞に感染・タンパク質の発現を行うことで機能改善が得られるかを評価する。また、ヒト疾患とＡＳＴＮ１遺伝子変異との関連を明らかにするために、ＡＳＴＮ１の病的バリアントを有する症例の集積を行っていく予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
追加研究のためのiPS細胞の維持と分化誘導実験を行う必要があるため。
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