研究課題
私達は、癌細胞膜の酸性スフィンゴ糖脂質が、シグナル分子の細胞膜ミクロドメイン（脂質ラフト）への局在を制御してシグナルの活性化と悪性形質の増強に働くことを明らかにしてきた。最近の私達の研究により、エクソソームとよばれる細胞外分泌小胞(EV)の構成脂質は脂質ラフト成分を多く含み、脂質ラフトの構成分子群とEV膜上の分子群が構造・機能的にリンクしている可能性が示唆された。よって、本研究では、癌関連酸性スフィンゴ糖脂質を含有するEVの構成分子の特性と癌微小環境における役割を明らかにする。そのために、今年度は、各種の酸性糖脂質糖鎖を発現するEVの構成分子を比較検討した。具体的には、酸性糖脂質のGM3のみを発現するヒトメラノーマ細胞株SK-MEL-28-N1細胞に各種の糖鎖合成酵素遺伝子を導入して作製した糖鎖改変細胞（コントロール（GM3(+)）細胞、GD3(+)細胞、GD2(+)細胞、GM2(+)細胞、GM1(+)細胞）を用い、その細胞培養上清から超遠心法によりEVを回収した。これらのEVについて、Tim4-beadsを用いたフローサイトメトリーによりGD3, GD2, GM2, 及びGM1発現を解析した結果、糖鎖改変細胞由来EVは、細胞に発現している糖脂質と同じ糖脂質の強い発現が認められた。EVの分泌量をタンパク量で比較検討した結果、各EVで差異は認められなかった。また、Nano Sightによる粒子径の測定では、いずれのEVも100 - 150nmであった。一方、癌関連糖鎖であるGD3またはGD2を発現するEVにおいては、他のEVと比較してEVマーカー分子であるCD63, TSG101, 及びAlix の強い発現が認められた。CD9及びCD81については、各EVで同程度の発現であった。今後は、これらの分子の脂質ラフト局在を解析すると共に、各種EVの生物活性についても比較検討する。
2: おおむね順調に進展している
糖鎖改変細胞（コントロール（GM3(+)）細胞、GD3(+)細胞、GD2(+)細胞、GM2(+)細胞、GM1(+)細胞）の細胞培養上清から、超遠心法により安定して細胞外分泌小胞(EV)が回収、単離できた。また、Western BlottingによりEVマーカー分子(CD63, TSG101)の発現を確認した。Nano Sightによる粒子径の測定では、これらのEVの粒子径は約100 - 150nmであり、エクソソームとよばれる細胞外分泌小胞の粒子径と同等であった。Tim4-beadsを用いたフローサイトメトリーによるEV膜上のGD3, GD2, GM2, 及びGM1発現を解析し、糖鎖改変細胞由来EVには細胞に発現している糖脂質と同じ糖脂質が強く発現することを明らかにした。更に、癌関連糖鎖であるGD3またはGD2を発現するEVにおいては、他のEVと比較してEVマーカー分子であるCD63, TSG101, 及びAlix の強い発現が認められることも明らかにした。以上のことより、研究はおおむね順調に進展している。
１. 細胞外分泌小胞（EV）の組成（脂質・糖脂質、タンパク質）の解析：１）癌関連酸性糖脂質であるGD3またはGD2含有EVに強く発現するCD63, TSG101 及び Alix について、細胞膜脂質ラフトの局在を検討する。２）EVのタンパク質組成のプロテオミクス解析を行う。検出されたEVの主な膜タンパク質について、細胞レベル（脂質ラフト）での発現をWestern blotting 及びフローサイトメトリーにより検討し、EVと細胞間の分子群の類似性を明らかにする。３）メラノサイト由来EVとメラノーマ細胞由来EVとの間で構成分子の異同について比較検討する。２. 細胞外分泌小胞（EV）の標的細胞に対する機能解析：１）各種の糖脂質糖鎖を含有するEVにより細胞を刺激した場合のAkt、Erkなどのシグナル分子のリン酸化パターンを比較検討する。２）EVによるシグナル分子のリン酸化におけるインテグリンの関与を検討するために、RGDなどのインテグリン阻害剤や抗インテグリン抗体を反応させ、リン酸化の変化を検討する。３）EVによるシグナル分子のリン酸化における糖脂質糖鎖の関与を検討するために、細胞またはEVに抗糖鎖抗体を反応させ、リン酸化の増減を解析する。４）癌関連糖脂質のGD3を含有するEVとNK細胞上のSiglec-7との相互作用及び、GD3含有EVによるNK細胞内のITIMの活性化と抑制シグナルによる細胞傷害活性の抑制を検討する。３. 種々の糖脂質糖鎖を有する細胞外分泌小胞（EV）の細胞への取り込みと動態の比較検討 ：１）各種の糖脂質発現細胞からEVを調製し、EV膜蛍光染色キットで標識後、各細胞への取り込みと細胞内局在を比較検討する。２）蛍光標識した各糖鎖含有EVをマウスに投与し、体内分布（肺、肝臓、骨、脳等）を比較検討する。
（理由）２０２１年度は、比較的実験が順調に進み、消耗品を効率よく使用することができた。一方で、新型コロナウィルスの影響で流通の遅れや品不足が起こり、購入が困難な試薬や消耗品などがあった。その結果、消耗品の支払いが遅れることもあった。また、大学で実験を行う際の行動制限により、実験が一時的に中断することがあった。（使用計画）（１）細胞外小胞（EV）を解析するために、細胞培養試薬、各種抗体、生化学試薬、分子生物学試薬などを購入する。（２）EVのプロテオミクス解析のための試薬および受託費用に使用する。（３）酸性糖脂質と細胞膜分子との相互作用を解析するために、各種の試薬および抗体を購入する。（４）実験補助のための人件費を支払う。
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