| 研究実績の概要 |
私達は、癌細胞膜の酸性スフィンゴ糖脂質が、シグナル分子の細胞膜ミクロドメイン（脂質ラフト）への局在を制御してシグナルの活性化と悪性形質の増強に働くことを明らかにしてきた。近年、私達は、エクソソームとよばれる細胞外小胞(EV)の構成脂質には脂質ラフト成分が多く含まれることを明らかにした。本研究では、癌関連酸性糖脂質を含有するEVの構成分子の特性と癌微小環境における役割を明らかにする。そのために、各種の酸性糖脂質糖鎖を発現するEVの構成分子を比較検討した。具体的には、酸性糖脂質のGM3のみを発現するヒトメラノーマ細胞株SK-MEL-28-N1細胞に各種の糖鎖合成酵素遺伝子を導入して作製した糖鎖改変細胞（コントロール（GM3(+)）細胞、GD3(+)細胞、GD2(+)細胞、GM2(+)細胞、GM1(+)細胞）を用い、その細胞培養上清から超遠心法によりEVを回収した。
Tim4-beadsを用いたフローサイトメトリーによりこれらのEVを解析した結果、細胞と同じ糖脂質がEVでも強く発現していた。Nano Sightによる粒子径測定では、いずれのEVも約100nmであった。EVの分泌量は各EVで差異は認められなかった。また、癌関連糖鎖であるGD3またはGD2を発現するEVでは、EVマーカー分子であるCD63, TSG101, 及びAlix の強い発現が認められ、更に活性型リン酸化Src(Yes)も検出された。Src阻害剤を用いて解析した結果、活性化SrcがEVにおけるこれらの分子の発現増強に関与することが示唆された。各種EVマーカー分子の脂質ラフト局在を解析した結果、各分子のラフト局在とEVにおける発現レベルは相関しなかった。EVの生物活性については、GD2発現EVをコントロール細胞に添加した結果、細胞の増殖性と接着性の亢進が認められ、そのメカニズムについて解析を行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
糖鎖改変細胞（コントロール（GM3(+)）細胞、GD3(+)細胞、GD2(+)細胞、GM2(+)細胞、GM1(+)細胞）の培養上清から、超遠心法により細胞外小胞(EV)を回収した。Tim4-beadsを用いたフローサイトメトリーにより、糖鎖改変細胞由来EVには細胞に発現している糖脂質と同じ糖脂質が強く発現することを明らかにした。Nano Sightによる粒子径の測定では、これらのEVの粒子径は約100nmであった。また、癌関連糖鎖であるGD3またはGD2を発現するEVにおいては、EVマーカー分子であるCD63, TSG101, 及びAlix の強い発現が認められた。更に、GD3(+)細胞およびGD2(+)細胞では活性化Src（Yes）が検出され、これらの細胞由来のEVでも活性化Srcが検出された。EVのCD63, TSG101, 及びAlixの発現に対する活性化Srcの関与を検討するために、リン酸化Srcの阻害剤であるDasatinibを用いて解析した。具体的には、GD2(+)細胞またはコントロール細胞にDasatinibを添加して培養し、その培養上清からEVを回収した。その結果、Dasatinibを添加した細胞から回収したGD2発現EVでは活性化Srcの減少と共にCD63, TSG101, 及びAlixの発現レベルの明らかな低下が認められた。一方、GD2非発現EV（コントロールEV）では、これらの分子の顕著な低下は認められなかった。従って、GD2(+)細胞の活性化SrcがGD2発現EVにおける CD63, TSG101, 及びAlixの発現増強に関与することが示唆された。EVの生物活性については、GD2発現EVをコントロール細胞に添加した結果、細胞の増殖性と接着性の亢進が認められた。以上のことより、研究はおおむね順調に進展している。
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