研究課題
慢性炎症は線維化・がん化の大きなリスクファクターであるが、その分子機序は不明であり、有用な慢性炎症関連病態モデルマウスは非常に少ない。故に引き金となる鍵分子の同定とそれを利用したモデルマウスの樹立は急務である。申請者はこれまでの先行実験により、炎症性サイトカインIL-1に応答して、下流のキナーゼIRAK1が従来のNFκB経路だけでなく、線維化やがん化に密接に関与するβ-カテニンを活性化することを見出し、そのシグナル軸の分子経路の解明に取り組んでいる。その結果、ヒト細胞株を用いた実験では、従来のIL-1受容体シグナルでIRAK1の上流のキナーゼであり、NFκB経路に必須なIRAK4は、Wnt経路の活性化に必要ないことを示唆する結果を得た。また、複数のIRAK1点変異体を作成し、ヒトIRAK1によるWnt経路の活性化には分子内に存在するヒト特異的な配列であるPPPSPモチーフが必要だということを明らかにした。さらに我々はPPPSP特異的リン酸化抗体を作成し、このモチーフがリン酸化されβ-カテニン分解因子であるGSK3βと結合することでβ-カテニンが活性化されることを見出すことができた。さらに、IL1-IRAK1シグナル軸の分子基盤の手がかりを得るために、IRAK1によるβ-カテニンの活性化に影響を与えるシグナル阻害剤の検索を、セルベースのレポータースクリーニングアッセイを用いて行い、影響を与える複数のシグナル阻害剤を同定した。PPPSPモチーフは類人猿にしか存在せず、マウスIRAK1はNFκB経路の活性のみで、Wnt活性化能は持たないので、組織特異的なヒトIRAK1亢進トランスジェニックマウスの作製と、ゲノム編集により２つのアミノ酸置換を施し、PPPSPモチーフを付与したヒト化IRAK1の作製に成功した。これらを用いて病態・表現型の解析に取り組んでいる。
2: おおむね順調に進展している
上記の通り、PPPSPモチーフの発見、リン酸化による制御、GSK3βとの相互作用など、IL-1リガンド-IRAK1シグナル軸のWnt活性化機構が明らかになりつつある。さらに、IL-1-IRAK1-β-カテニンシグナル軸への未知のシグナル経路の関与の可能性を探るめに、セルベースのレポータースクリーニングを実行した。まず、β-カテニンの活性を定量化できるTCF依存的レポーター遺伝子が導入され、かつ活性型ヒトIRAK1を恒常的に発現するヒト肺がん細胞株H1299TR-hIRAK1とヒトグリオーマ細胞株U２５１TR-hIRAK1を樹立した。この細胞と、文科省支援提供によるシグナル阻害剤キット（約400種）を用いて、レポータースクリーニングを実行し、２種の細胞株で再現性を示す各種AKT阻害剤を含む、複数のシグナル阻害剤を同定した。その後これらがヒトIRAK1のリン酸化を抑制することがわかり、この経路への関与の可能性がさらに強まった。Wnt経路活性化能はマウスIrak1に保存されておらず、Wnt経路活性化能の獲得には点変異の導入を必要とする。そこでヒトのIRAK1を用いたマウスの病態解析のために以下のマウスを樹立した。(1)マウスIrak1遺伝子座の相同領域に変異を導入し、Wnt経路活性化モチーフを付与したゲノム編集Irak1マウス（以下、ヒト化Irak1マウス）、(2)セーフハーバー遺伝子座Rosa26に、遺伝子組み換え酵素Cre依存的ヒトIRAK1遺伝子発現カセットを導入したマウス（以下、ヒトIRAK1-Tgマウス）の2種のゲノム編集マウスを用いてin vivoで仮説検証を行う。ヒトIRAK1-Tgマウスについては、肺特異的に誘導型Cre組み換え酵素（CreERT2）発現マウスとの交配と、タモキシフェン投与により時期・組織特異的にヒトIRAK1を高発現させる条件の検討を始めた。
ヒトIL-1-IRAK1-β-カテニンシグナル軸の作用機序プロジェクトや、レポータースクリーニングで同定された阻害剤に関する研究をさらに推進し、それらの作用点について注目し、結合性、タンパク質修飾、シグナル伝達における位置関係に注目して、生化学的、細胞生物学的手法により解析を進めて、さらに、このシグナル軸の分子基盤の解明を目指す。これまでの先行実験では、文献に報告されたグリオーマで見つかったヒトIRAK1の点変異体がβ-カテニンをより強力に活性化することがわかっている。それに加えて、データベースで検索すると、種々のがんにおいて多様な点変異があることが明らかとなったので、顕著な点変異に関して、それぞれヒト細胞への発現用DNAコンストラクトを作製して、NFκBならびにβ-カテニンの活性化能を野生型IRAK1と比較し、より強い活性を持つ変異体の同定を進めており、幾つかの体細胞変異を見つけているが、さらに継続して、最終的に一番活性の強い変異体をマウスに導入して病態解析を進める。これらのゲノム編集マウスのヒト化Irak1およびヒトIRAK1の発現量を免疫組織染色で確認したのち、通常飼育環境下での肺の病態の有無を経時的に観察する。具体的には、組織に生じた線維化や腫瘍等の形態的解析、HE染色や死細胞を検出するTUNEL法、細胞増殖マーカーや分子マーカーの免疫組織染色による病理学的解析により、ヒト化Irak1とヒトIRAK1発現の病態の有無を評価する。しかしながら、顕著な表現型が確認できない場合はLPSやブレオマイシンなどを投与することによる化学炎症を誘導して、ヒトIRAK1の機能と炎症との相乗効果を検討する。
おおむね使用使用したが、残りは来年度の論文投稿料に充てる予定である。
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Genes Cells
巻: 27(10) ページ: 602-612
10.1111/gtc.12979.
https://www.uoeh-u.ac.jp/medicine/seika.html
