| 研究課題/領域番号 |
21K06831
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
高崎 真美 国立研究開発法人理化学研究所, バイオリソース研究センター, 開発研究員 (80392009)
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| 研究分担者 |
林 洋平 国立研究開発法人理化学研究所, バイオリソース研究センター, チームリーダー (90780130)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 22q11.2欠失症候群 / 疾患特異的iPS細胞 / 神経堤細胞 |
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| 研究実績の概要 |
近年、患者由来細胞や疾患特異的iPS細胞の細胞バンクへの寄託が増加傾向にあるが、その品質には寄託元によってばらつきがある。よって、実際の研究に用いる前に細胞の品質をチェックし、病態モデルとして適切な細胞であるかを評価することは重要である。
そこで本年度は、理研細胞バンクより購入した22q11.2欠失症候群患者由来iPS細胞（HPS1627、HPS2296）、Coriell Instituteより購入した22q11.2欠失症候群患者由来線維芽細胞（GM03479、GM05876、GM13325）から、所属研究室にて独自に樹立したiPS細胞の特性解析を行い、その品質を評価した。
品質評価の項目として、iPS細胞樹立に使用したエピソーマルベクター残存の有無（EBNA1遺伝子）、多能性マーカーの発現解析（免疫染色、フローサイトメトリー）、胚葉体形成による三胚葉分化能の確認と免疫不全マウスへの移植によるテラトーマ形成実験、核型解析による染色体異常の確認、等を行った。
一連の特性解析の結果、HPS1627、HPS2296、GM05876由来iPS細胞、GM13325由来iPS細胞は、その品質に問題ないことが確認された。一方、患者由来線維芽細胞GM03479より樹立したiPS細胞は、22q11.2領域での欠失が確認されなかったことから、病態モデル用のiPS細胞としては不適切と判断し、本研究では使用しないこととした。
本特性解析の結果は、論文として国際学術誌（Stem Cell Res. 2022, 61: 102744）に掲載された。また、GM05876由来iPS細胞及びGM13325由来iPS細胞は、それぞれHiPS-GM05876、HiPS-GM13325として、理研細胞バンクへ寄託手続きを行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
マウスを用いたテラトーマ形成実験に想定より時間がかかったこと、22q11.2欠失症候群患者由来iPS細胞の特性解析の結果を国際学術誌へ投稿するために、論文執筆と追加実験に注力した、などの理由から、当初予定していたiPS細胞の神経堤細胞への分化実験の開始に遅れが生じた。
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| 今後の研究の推進方策 |
22q11.2欠失症候群の神経堤細胞における病態モデルを確立するため、これまでの実験結果から病態モデルに利用可能と判断したiPS細胞株（HPS1627、HPS2296、HiPS-GM05876、HiPS-GM13325）と健常者由来iPS細胞株を材料に、研究代表者が独自に開発した培養法を用いて神経堤細胞への分化実験を進める。
神経堤細胞への分化効率の評価は、免疫染色（SOX10）及びフローサイトメトリー（p75陽性細胞の検出）の手法にて行う。神経堤への分化効率に有意な差が見られたiPS細胞株は、誘導初期に働く遺伝子の発現異常に原因があると考えられる。この特徴を示した株について、RNAseqによる全トランスクリプトーム解析を行い、健常人由来サンプルと有意に発現量の異なる遺伝子を同定する。候補因子が絞られた後は、健常人由来iPS細胞でのノックダウン実験や疾患由来iPS細胞での強制発現実験等を行い、神経堤細胞分化効率を検証する。
神経堤分化実験で分化効率に有意な差が見られなかった疾患由来iPS細胞株では、神経堤細胞の遊走能の低下またはその後の分化能（末梢神経、骨、軟骨など）に異常がある可能性がある。この検証のため、分化誘導した神経堤細胞を神経堤細胞特的表面抗原p75を指標にフローサイトメトリーにて分取して増幅後、神経堤細胞の遊走能を評価する。分化能に関しては、p75陽性細胞の末梢神経、骨、軟骨への分化実験を行い、健常人由来iPS細胞と比較する。
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