研究課題
RFX6遺伝子座へEGFP遺伝子をBAC vectorのelectroporationにより挿入し、機能喪失性マーカーknock-in細胞の樹立を試みた。knock-in iPSは辺縁整のコロニーを形成し、ALP活性を有し 未分化蛋白を発現し継代可能であった。胚様体形成による三胚葉への分化を免疫染色で検出し多能性を確認した。FISHで挿入遺伝子はRFX6遺伝子座(6q21-6q22)のみにシグナルを認め核型異常もなかった。GSK3β阻害薬とActivinにより胚体内胚葉・腸管分化系を誘導した。4日後に初期内胚葉(SOX17, FOXA2)、10日後にRFX6と共に後方前腸(PDX1)、中後腸(CDX2)の遺伝子発現上昇をみた。RFX6の遺伝子発現と蛋白量は対照iPSと比較しヘテロで半減しホモで消失した。EGFP遺伝子発現と蛋白量、蛍光シグナルはヘテロ、ホモのみで上昇した。多能性幹細胞としての性質とEGFPレポーターの動態から、RFX6-EGFP knock-in hiPS細胞の樹立に成功した。中後腸分化系において、RFX6の遺伝子量に応じたPDX1, CDX2の段階的な発現低下を認めた。RNA-seqによりRFX6が制御する遺伝子を検討したところ、それら以外にも膵腸管内分泌細胞分化に必須の転写因子NGN3の低下が検出された。また、RFX6が認識するelementは未解明であるためCAGE（Cap Analysis of Gene Expression）法を用いてRFX6の結合モチーフ候補を導いた。このモチーフはPDX1, CDX2遺伝子周辺に存在しており、293細胞で合成したRFX6蛋白を用いてelementについてのEMSAを行ったところ実際に結合することが確認でき、原始腸管でRFX6が前後軸や内分泌細胞への分化を制御していることが確認できた。
2: おおむね順調に進展している
今回、腸管形成不全や膵低形成を来す先天疾患であるMitchell-Riley症候群の原因遺伝子であるとともに、全ゲノム解析において2型糖尿病の疾患感受性遺伝子として検出されたRFX6に着目した。RFX6は原始腸管（中・後腸）、腸管内分泌前駆細胞、GIP産生細胞（K細胞）、成熟膵β細胞等での特異的発現が認められており、膵腸管や内分泌細胞の発生・機能面での病態生理的作用が注目されてきた。しかし、RFX6には免疫染色に利用可能な抗体が無く、転写因子ヒエラルキーの上下や結合エレメントのモチーフなど未解明な事柄が多く、検討は進んでいなかった。今回、RFX6の機能を喪失する形でEGFP蛍光遺伝子をknock-inしたヒトiPS細胞を樹立することに成功した。Plasmidを用いた相同組み換えはknock outマウス作成におけるマウスES細胞での標準技術であるが、ヒトES/iPS細胞では困難であり、homology armを長く有する大腸菌人工染色体（BAC）を利用することで、克服した。そのうえで、この細胞に膵腸管細胞への分化系を適用し、各分化段階におけるマーカー遺伝子の発現から膵腸管への分化系が妥当であることの検証を行いつつ、RFX6下流にPDX1, CDX2, NGN3といういずれも膵腸管・内分泌細胞に非常に重要な作用を及ぼしている転写因子を同定することができた。更に、RFX6の膵腸管発生時に利用していると想定される新規モチーフもCAGE法を用いて同定することができた。今後、同様の手法を用いRFX6の病態生理機能の解明が期待される。
今回RFX6が染色体13qに存在するPDX1とCDX2とを正に制御しており、それらの遺伝子近傍にはCATGGCAAという新規に結合が確認されたmotifが存在することも判明した。PDX1は膵十二指腸発生制御のマスター遺伝子でありその欠損は膵欠失となるうえに、膵β細胞で高発現しインスリン、GLUT2, GK等の発現を刺激することにより糖感受性インスリン分泌を特徴づけている。CDX2は腸管細胞に広く発現しており、これら2つの遺伝子はホメオドメインを有し発現エリアが腸管上部と下部に分かれ腸管を区域性に制御している。今後、Mitchell-Riley症候群のphenotypeを説明しうる他のRFX6下流遺伝子の検討、また、RFX6発現の上流因子についての探索を行う。網羅的遺伝子発現解析ではプロカドヘリンファミリー遺伝子発現の変化があったことから、形態学的異常と細胞接着因子との関連につき検討する。また、成熟膵誘導あるいは腸管誘導プロトコールを用いてMitchell-Riley症候群病態モデルを証明し、RFX6のより発生成熟段階における制御機構や生理学的機能を明らかにする。研究計画を遂行する上での課題として、いくつかのin vitro腸管オルガノイド誘導系で細胞株の違いなどによるものが一因と考えられるオルガノイド形成のばらつきがあり、条件検討を行うことと並行し、途中段階までin vitroで誘導したものを免疫不全マウスへ移植し、in vivoでの成熟分化を行うことによる機能的評価での代替的評価についても検討している。また、同様に腸管で発現するPPARγ発現をモニタリングするhiPS細胞を樹立する予定である。PPARγは膵腸管のみならず白色・褐色脂肪細胞など糖代謝異常に関与する組織の制御を担っており、分化指標として利用する予定である。
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