研究課題
本研究では、ヒトにボツリヌス中毒を起こす血清型A、B、E、F型毒素に対する安全で高い中和力価を持ち、なおかつ生産効率の良い抗毒素抗体製剤セットの作出を目指す。我々はこれまでにB型ボツリヌス毒素 (BoNT/B) に対して高い中和活性を持つヒト型モノクローナル抗体（M2及びM4）の作製に成功している。M2はBoNT/Bの軽鎖、M4は重鎖を認識しマウスバイオアッセイにおいて中和活性を示し、M2とM4を組み合わせることにより、中和活性が飛躍的に上がることを明らかにしているが、これらの中和メカニズムは不明である。BoNT/Bは、神経細胞へ結合後、小胞として取り込まれ、細胞内で軽鎖が細胞質へtranslocationし、基質であるシナプス小胞タンパク質 (VAMP2) を切断する。抗体がそれぞれどの段階に作用しているのか、中和メカニズムの解明を試みた。その結果、M4は神経細胞であるPC12細胞へのBoNT/Bの結合を阻害した。一方で、M2はBoNT/BのPC12細胞への結合及び取り込み、基質であるVAMP2の切断に対して阻害作用は無かった。M2は軽鎖に結合するが、酵素活性に対する阻害作用は持たず、軽鎖の小胞内から細胞質への移行を阻害している可能性が考えられた。A型ボツリヌス毒素（BoNT/A）に対するヒト型抗体産生細胞（CHO細胞）は4種(NT-523、NT-320、BT-015、BT-175)樹立できている。これらを無血清培地中で培養し、培養上清を得た。その上清を用いて、Western blotを行い、各クローンの培地中へのヒト型抗体の産生を確認した。またELISAにてBoNT/Aに対する結合、マウスバイオアッセイにてBoNT/Aに対する中和活性を確認し、中和抗体が産生されていることを確認した。抗体産生量が低かったNT-523に関してはコドン最適化を行い、産生量の向上を確認した。
2: おおむね順調に進展している
我々はこれまでにB型ボツリヌス毒素 (BoNT/B) に対して高い中和活性を持つヒト型モノクローナル抗体（M2及びM4）の作製に成功しているが、これらの中和メカニズムは不明である。今回中和メカニズムの解明を試み、M4がBoNT/Bの神経細胞への結合を阻害し、M2が神経細胞への結合及び基質（VAMP2）の切断以外の過程を阻害していることを明らかにした。A型ボツリヌス毒素 (BoNT/A) に対するヒト型抗体については、培養上清を用いて3 種の抗体（NT-320、BT-015、BT-175）の中和活性を確認し、コドン最適化によりNT-523 の産生効率を改善した。当初の計画通りM2及びM4のBoNT/B中和メカニズムの解析とBoNT/Aに対するヒト型抗体の機能解析を進めることができている。
BoNT/Bに対するヒト型抗体については、M4はBoNT/Bの神経細胞への結合を阻害することを明らかにしたが、M2の中和メカニズムは不明である。M2は軽鎖に結合するが、酵素活性に対する阻害作用は無かった。軽鎖の小胞内から細胞質への移行を阻害している可能性が考えられるため、translocationの過程を解析する実験系を立ち上げ、M2の作用を解析する。また、抗体の大量精製に向けて、動物細胞における組換えM2及びM4の発現系の立ち上げに着手する。BoNT/Aに対するヒト型抗体については、培養上清からIgGを精製し、結合及び中和活性を確認する。また、各抗体のエピトープが重複していないかを確認するためにCompetitive ELISAを実施する。さらに、BoNT/Aのどのドメインを認識しているかを解析するために各ドメインの組換えタンパク質を作製する。
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