| 研究課題/領域番号 |
21K07031
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| 研究機関 | 順天堂大学 |
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研究代表者 |
多田 達哉 順天堂大学, 医学部, 准教授 (00624644)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | エリザベスキンジア属菌 / アミノグリコシド耐性 / rRNAメチラーゼ |
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| 研究実績の概要 |
高度多剤耐性エリザベスキンジア属菌が先進国を中心に開発途上国においても院内感染起因菌として医療安全を脅かすようになってきた。我々はネパールおよびミャンマーの医療施設から分離されたエリザベスキンジア属菌の薬剤耐性プロファイルおよびゲノム解析を実施した。その結果、本菌は治療に有効な薬剤すべてに耐性を示す汎薬剤耐性であったが、カルバペネム耐性因子以外は不明であり、未知の薬剤耐性因子を保有していることが示唆された。
ネパールで分離されたエリザベスキンジア・アノフェリスJUNP353株はすべてのアミノグリコシド系薬にMIC 64ug/ml以上の高度耐性を示す。本菌からゲノムを抽出し、4塩基認識の制限酵素Sau3AIにて消化後、pHSG398にクローニングし、大腸菌DH5αに形質転換した。クロラムフェニコール及びアミカシンを含むLB培地にてスクリーニングを行った結果、両薬剤に耐性を持つコロニーを得た。本コロニーから遺伝子を抽出し、ベクターのマルチクローニングサイトをシーケンスした結果、約7kbの配列が得られた。この配列を基にorfを抽出鹿結果、23S rRNAメチラーゼと予想される配列が見つかった。本は配列を再度pHSG398にクローニング氏、各種アミノグリコシド系薬に対するMICを決定したところ、ほぼすべてのアミノグリコシド系薬に対する感受性の低下がみられた。カルバペネム耐性因子に関しては、タイプストレインとの比較ゲノム解析から、カルバペネム耐性に関与するメタロ-β-ラクタマーゼに5つのアミノ酸変異があることが分かった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
耐性因子を含む大腸菌のスクリーニングを順調に遂行することができ、新規薬剤耐性因子の候補遺伝子を抽出することができたため。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後、初年度にスクリーニングしたアミノグリコシド耐性因子であるrRNAメチラーゼにおけるメチレーションサイトをプライマーエクステンション法にて決定する。さらに、エリザベスキンジア・アノフェリスのタイプストレインを入手し、薬剤感受性試験を実施した結果、カルバペネムに対して感受性であることが分かった。タイプストレインのゲノムを抽出し、比較ゲノム解析を行った結果、ネパールで分離されたカルバペネム高度耐性株には生来保有しているカルバペネム耐性に関与するメタロ-β-ラクタマーゼに5つのアミノ酸変異があることが分かった。今後はカルバペネム耐性に寄与する変異を特定していく。さらに、カイコ毒性が認められた本菌において、DNAライブラリーを作製し、その大腸菌をカイコに接種することで病原因子のスクリーニングを行う。具体的に方法は本菌からゲノムを抽出し、4塩基認識の制限酵素Sau3AIにて消化後、pHSG398にクローニングし、大腸菌DH5αに形質転換する。クロラムフェニコールを含むLB培地にてスクリーニングを行い、エリザベスキンジア菌のゲノム断片を保有する大腸菌ライブラリーを作製し、順次カイコに接種し、LD50が低いコロニーから病原因子を特定する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
次年度使用額が発生した理由は2点ある。1つ目は新型コロナウイルスの影響で試薬の調達ができなかった、2つ目は購入を予定していた試薬が生産を修了してしまったためである。
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