2022 年度実施状況報告書

ABC輸送体の発現抑制による細胞死誘導機構と抗腫瘍効果の解析

研究課題

研究課題/領域番号	21K07124
研究機関	岡山大学
研究代表者	小渕浩嗣岡山大学, 医歯薬学域, 講師 (10304297)
研究分担者	藤田洋史岡山大学, 医歯薬学域, 助教 (20423288)
研究期間 (年度)	2021-04-01 – 2024-03-31
キーワード	ABCトランスポーター / がん / 低分子二本鎖RNA / 遺伝子発現抑制 / 細胞死 / アポトーシス
研究実績の概要	ATP-binding cassette transporter G2 (ABCG2)は、様々な薬剤や生理活性物質を体外に排出する生体バリア機能を担う輸送体である。代表者はABCG2機能阻害の手段として、siRNAによるABCG2遺伝子ノックダウンが、各種のがん細胞で増殖抑制や細胞死が誘導されることを見出し、その細胞死シグナル伝達機構やABCトランスポーターの新たな生理的意義を明らかにすることを目的としている。令和３年度は、種々のがん細胞株における各種ABCトランスポーターの発現抑制と細胞生存率の解析を中心に行い、ABCG2遺伝子の他に、ATP-binding cassette subfamily B Member 1(ABCB1,別名：P-Glycoprotein 1)、Multidrug resistance-associated protein 1(ABCC1)など、主として薬剤や生理活性物質を細胞外へ排出するABCトランスポーターについて検討した。その結果、ABCG2以外でも細胞生存率を有意に低下させるABCトランスポーター遺伝子の存在を認めた。その割合はABCG2遺伝子抑制と比較すると低いものであったが、何らかの共通点が存在する可能性も否定できない。この点については、今後の課題として解析を試みる。令和４年度は、令和３年度に得た結果をさらに進展させる研究を実施すると共に、ABCG2ノックダウンによる細胞死誘導メカニズムの解析ならびに低酸素誘導因子(HIF-1: hypoxia-inducible factor-1)について、低酸素培養キットを用いた解析を行い、ABCG2発現抑制によってHIF-1活性がどのような影響を受け、がん悪性化との関わりについて検討を行っている。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 3: やや遅れている理由申請当初は、自家発光遺伝子を搭載したpCMVluxプラスミドベクター（490 BioTech社）を細胞に導入することで、通常、解析時に必要なルシフェリンなど基質に左右されない「恒常発光がん細胞」を各種のがん細胞から新たに作成し、それらを用いて実験する予定であった。しかし、当該プラスミドベクターやそれを導入した細胞も販売停止となったため、改めて細胞株の選定を行った。最終的には、In vivoイメージングで実績のあるルシフェラーゼ遺伝子を導入した膵臓がんをはじめとする細胞株を購入して各実験を行いABCG2だけでなく他のABCトランスポーター遺伝子のノックダウンによる細胞死が様々ながん細胞株で確認された。よって、計画にはないが今後の研究を遂行する上で重要な問題と考えられABCトランスポーター遺伝子抑制による細胞死の解明を進めている。この解析結果は今後の研究に資するものである。しかし、当初の項目である「細胞死シグナル伝達経路の解析」ならびに「ＨＩＦ－１関連の解析」の実験がやや遅れている。大きな理由としては、教室に所属していた教授ならびに助手の２人が退職するにあたり、教室内の機器や試薬など様々な整理と処分に多大な時間を費やさねばならなかったこと等が挙げられる。
今後の研究の推進方策	今後は、ルシフェラーゼ遺伝子を導入した膵臓がんなど数種のがん細胞におけるABCG2遺伝子のノックダウンによる細胞死誘導メカニズムの解析、また計画項目として挙げている低酸素誘導因子(HIF-1: hypoxia-inducible factor-1)については、低酸素培養キットを用いて研究を進める。がん細胞におけるABCG2発現抑制によってHIF-1活性がどのような影響を受け、がん悪性化とABCG2発現の関わりについて解析を行い、ABCG2の役割を明らかにすることを目指す。さらには、マウスの皮下に移植したがん細胞へのABCG2siRNA投与による発現抑制が、がん細胞の増殖にどのように影響するかをin vivoイメ－ジングにより解析する予定である。
次年度使用額が生じた理由	「現在までの進捗状況」にも記載したが、申請書で予定していた自家発光遺伝子pCMVluxプラスミドベクターが販売停止となったため、この遺伝子を購入し、導入させた細胞を実験に利用できなくなったことが理由の１つである。代替の実験材料としてルシフェラーゼ導入がん細胞株を購入したが、これまでのIn vivoイメージング実験において大きな実績のある細胞であるため、研究成果には支障はないものと考えている。その他には、教室員の退職に伴い、教室内の機器や試薬などの整理と処分に多大な時間を割かなければならなかったこと、今まで実験に使用していた機器が他の研究室へ移設されたことやその他の機器の故障が重なったことにより研究を中断しなければなかった。また、担当する授業の多くが責任者としての役割を果たす必要があったことも理由の１つである。今後は、計画が遅れている細胞死誘導シグナル伝達経路の解析や低酸素誘導因子の解析に必要な試薬および物品ならびにin vivo解析のための試薬等を購入し、それぞれの解析を進める予定である。