| 研究課題/領域番号 |
21K07168
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
金子 美華 東北大学, 医学系研究科, 准教授 (00323163)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | CasMab / 抗体創薬 / 抗体医薬 / 腫瘍型糖鎖構造 / 腫瘍特異的 |
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| 研究実績の概要 |
Cancer-specific monoclonal antibody (CasMab) 法とは、がん特異的な反応性を示す抗体を樹立する方法として我々が開発した独自技術である。これまで、CasMab法を用いて、細胞表面に発現しているI型膜タンパク質の糖鎖付加部位の違い、あるいは、糖鎖の違いを見分ける抗体を戦略的に樹立してきた（Kato and Kaneko, Sci. Rep., 2014）。
本研究課題では、がん細胞、正常細胞の両方共に発現しているタンパク質を標的として、既に抗体医薬が開発されているがより優れた抗体が求められるもの、及び、抗体医薬が存在しない新規のものを標的分子として、がん特異的抗体の樹立を目指している。また、樹立したがん特異的抗体を利用し、腫瘍型糖鎖構造の実態を解明し、腫瘍型標的分子のがん細胞形質への関与を解析する計画である。さらに、がん特異的抗体の抗体医薬開発の可能性を、遺伝子改変技術を用いて検証する計画である。
研究計画に基づいて、令和３年度は、主として標的分子の強制発現細胞株をマウスまたはラットに免疫することにより、標的分子４種類に対する抗体ライブラリーの作製を遂行した。各標的分子に対して、100クローンを超えて、ハイブリドーマを樹立している。抗体樹立のスクリーニングとしては、親株と発現株に対する反応性の違い、また、内在性発現株とそのノックアウト細胞株に対する反応性の違いなどを用いて、フローサイトメトリー法にて検出した。樹立した抗体について、種々のアプリケーションへの有用性を検証した。また、標準候補抗体、いずれかのアプリケーションでCasMab傾向を示した候補抗体については、エピトープ探索実験を遂行した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
研究計画に基づき、「標的分子に対し、CasMab法を用いてがん特異的抗体を樹立」を遂行しつつ、樹立した抗体を用いて、順次、FACS, WB, ELISA, 免疫染色など、種々のアプリケーションでの反応性を確認した。より多くのアプリケーションに使用可能な抗体を標準候補抗体として、また、いずれかのアプリケーションで腫瘍特異性を示した抗体をCasMab候補抗体と設定して、それぞれの候補抗体の「エピトープ検索実験」を遂行していた。
エピトープ検索実験は、そもそも、CasMab候補抗体の認識部位に関連すると想定される、腫瘍型糖鎖構造付加部位を解明することを目的として、候補抗体の抗原認識部位を特定する実験である。標的分子のN末端側もしくはC末端側からドメイン毎、または任意の数のアミノ酸毎に削り込んだdeletion型分子を細胞株に強制発現し、候補抗体の反応性から、標的分子のどの部位にエピトープが存在するか、すなわち、腫瘍型糖鎖構造が付加されているか、を推定した。または、我々が開発したRIEDL tag 挿入epitope破壊法を実施することで、エピトープ（または腫瘍型糖鎖付加部位）を推定した。
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| 今後の研究の推進方策 |
引き続き、CasMab法によって得られた抗体の性状解析を実施する。具体的な研究内容は以下の通り。
（１）エピトープ探索実験の実施：腫瘍型糖鎖構造付加を解明するため、抗体の認識部位を特定する。N末端側またはC末端側からドメインごとに削り込んだdeletion分子を細胞株に強制発現し、候補抗体の反応性から標的分子のどの部位にエピトープが存在するかを推定する。アミノ酸置換実験（アラニンスキャン）、または、申請者らの開発したtag 挿入epitope破壊法を実施することで、エピトープ部位の特定が可能となる。
（２）腫瘍型糖鎖構造の生合成に関与する糖転移酵素遺伝子群の推定：標的分子を内在性または強制的に発現しているがん細胞株を用い、がん特異的抗体の反応性を調べる（抗体反応性プロファイル）。申請者がこれまでの研究で蓄積したがん細胞株糖鎖遺伝子プロファイルと比較検討し、腫瘍型糖鎖構造付加に関与する糖転移酵素遺伝子の候補を推定する。また、糖転移酵素遺伝子ノックアウト細胞株（糖鎖不全株）を用い、腫瘍型糖鎖構造と生合成経路の推定をする。
（３）腫瘍型糖鎖付加標的分子のがん細胞での機能解析：糖鎖不全株もしくは糖転移酵素遺伝子強制発現細胞株を用い、対象とした腫瘍型糖鎖構造付加標的分子の、がん細胞形質（多分化能・自己複製能など）やがんの浸潤能・運動能などへの機能的関与を調べる。
（４）種々の抗体活性の検証：抗体遺伝子を取得し、遺伝子組換えによりヒト定常領域とのキメラ型抗体を作製する。作製したキメラ型抗体の抗体依存性細胞障害活性（antibody-dependent cellular cytotoxicity: ADCC）や補体依存性細胞障害活性（complement dependent cytotoxicity: CDC）を調べる。
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