| 研究実績の概要 |
昨年度は独自技術である分子設計技術に基づき(特許第5971788号)、急性前骨髄性白血病（APL）に関与するSIAH-1活性部位を移植した人工E3の合成を行い、ウエスタンブロットにてユビキチン化の機能確認を実施した。今年度は、蛍光標識した人工E3(FAM-人工Ｅ３)とユビキチン結合酵素(E2)との相互作用を蛍光分光計で測定できることが新たに明らかになった。E2の濃度を変化させることで、その依存的にFAM-人工Ｅ３の蛍光強度が増加した。これをプロットし、FAM-人工Ｅ３とE2との結合定数Ｋｄをフィッテイングカーブより算出した。Ｅ２はUbcH5bを使用したが、異なるＥ２でも検討する予定である。一方、ユビキチン化の度合いを蛍光偏光法（分光蛍光光度計 F-7100, 日立製）でリアルタイムで定量的に計測するために、蛍光標識した人工E3、ユビキチン、Ｅ１，Ｅ２など必要な試薬を混合させて、人工E3のユビキチン化を生じさせた。人工E3はモノユビキチン化されると分子量が増加するので、蛍光異方性が変化すると期待していたが、ユビキチン化反応を定量的に捉えることができるほど十分な感度での検出ができなかった。次年度では、ポリユビキチン化する人工E3を設計・合成して、そのユビキチン化の度合いを蛍光偏光法で検討する。モノユビキチン化よりもポリユビキチン化の方が、より高分子化するので高感度に計測できると期待できる。
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