| 研究課題/領域番号 |
21K07302
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| 研究機関 | 東京慈恵会医科大学 |
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研究代表者 |
岡野 ジェイムス洋尚 東京慈恵会医科大学, 医学部, 教授 (90338020)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | パーキンソン病 / VPS35 / レトロマー / 新規オートファジー / Rab9 |
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| 研究実績の概要 |
家族性パーキンソン病の一つであるPARK17はエンドソーム輸送を担うレトロマーの構成因子VPS35のD620N変異によって発症する。レトロマーの生理機能から考察して、細胞にとって最も基本的な恒常性維持機構である細胞内輸送の障害が、二次的にリソゾーム、ミトコンドリア、オートファジーの機能不全を引き起こしうるのではないかという仮説をたてパーキンソン病の根幹病態の解析を行なった。１年目は、培養細胞に変異型（D620N）VPS35を強制発現させ、ライブイメージングにより低分子量GTP結合タンパク質Rab9とVPS35の共局在、及びRab9・リソソームの共局在を調べた。その結果、野生型VPS35と比較して変異型VPS35は、細胞が飢餓状態時に、Rab9を含む小胞との相互作用が優位に低下することが明らかになった。また変異型VPS35存在下ではRab9とリソソームの共局在が減少していた。さらにATG5の発現を抑制するとRab9のリソソームへの取り込みが変異型VPS35群で顕著に減少した。これらの知見からVPS35が何らかのメカニズムでRab9を介した新規オートファジー制御に関与している可能性が強く示唆された。以前の研究で、PARK17の患者iPS細胞から分化誘導したニューロン（iNeuron）においてエンドソームの輸送障害アルファ-シヌクレインの細胞内蓄積、ドパミンニューロンの細胞死が起こることが明らかになっているが、２年目はPARK17 iNeuronにおいて、オートファジー制御の異常について詳細に解析する予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
２０２１年度はHeLa細胞を用いて変異型VPS35の細胞内小胞輸送、リソソーム機能、オートファジーへの影響について検討した。細胞を4時間のstarvation下におきRab9とリソソームマーカーLAMP1の免疫染色を行なったところ、変異型VPS35発現細胞では野生型VPS35発現細胞と比較して優位に共局在が低下した。次にリソソームと小胞の融合を調べるためmCherry-GFP-Rab9レポーターを細胞に導入して同様の実験を行なったところ変異型群で優位に融合が低下し、siRNAによりATG5を抑制するとさらに顕著な融合抑制が見られた。興味深いことにエストロゲンを添加すると、変異型群で観察されたRab9・リソソーム融合抑制が解除され、ATG5抑制下でも同様の結果が得られた。Cyto-ID添加によりオートファジーを検出して調べたところ、ATG5抑制時に変異型群では優位にオートファジーが低下しており、エストロゲンを添加すると回復することがわかった。しかし、エストロゲンは野生型群には影響しなかった。これらの結果から、変異型VPS35は新規オートファジーを抑制することが強く示唆された。新規オートファジー評価法を確立したことにより、２０２２年度に開始する疾患iPS細胞由来ドパミンニューロンを用いたパーキンソン病の病態研究及び治療戦略研究につなげることができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
PARK17患者由来iPS細胞・健常コントロール細胞からドパミンニューロンを分化誘導し、まだ未解析のレトロマー機能の障害の有無を検証する。さらに異常形質の是正を指標に治療戦略を提案する。リソゾーム機能障害の検証：リソゾームの形態、数、移動、リソゾーム酵素活性の評価を行う。Lysotrackerによるイメージング、カテプシンD前駆体の発現量の定量を行う。ミトコンドリア機能障害の検証：Mitotrackerライブイメージングによりミトコンドリアのfissonおよびfusionの頻度を計測する：ミトコンドリア膜電位を計測する。ミトコンドリア長を測定し断片化の有無を判定する。オートファジー障害の検証：p62、LC3の免疫染色、Cyto-IDおよびAutophagy Flux Assayにより評価する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
次年度使用額が生じた理由は、新型コロナウイルス蔓延により研究室への出入りが制限されたこともあり、長期間にわたって培養しなくてはならないiPS細胞を用いた実験が滞ったためである。２０２２年度の研究計画では、ヒトiPS細胞を培養し分化誘導を行って解析するために高価な細胞培養試薬・遺伝子発現解析試薬を多数使用する必要がある。そのため、次年度使用額と２０２１年度請求額を合わせた金額を主に物品費に計上し、これらの試薬を購入する計画である。
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