| 研究課題/領域番号 |
21K07337
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| 研究機関 | 愛知医科大学 |
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研究代表者 |
藤川 誠 愛知医科大学, 医学部, 助教 (90573048)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | アルツハイマー病 / ミトコンドリア / ATP合成酵素 |
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| 研究実績の概要 |
研究計画調書において、アルツハイマー病モデルマウスである AppNL-G-F マウスをを用いてアミロイドβが脳内に沈着し始める2月齢前後で血球のATP合成活性が変化することを見出したと述べた。本研究課題では、2つの目標を設定した。1つは、この ATP合成活性が変化するメカニズムを解明することである。もう1つは ATP合成活性の変化をアルツハイマー病の早期発見に利用できるか検証することである。
アルツハイマー病モデルマウスの脳内にアミロイドβが沈着する直前には、グリセロール-3-リン酸 (G3P) を基質として用いるATP合成活性が血小板において亢進していた。この G3P を直接の基質として電子伝達系に含まれる呼吸鎖 III を駆動するのは GPD2 というミトコンドリア表在蛋白質である。そこで、野生型および AppNL-G-F ホモ接合型マウスから得た全血から密度勾配遠心などを経て血小板を調製した。血小板から蛋白質を抽出してウエスタンブロットにより GPD2 蛋白質の発現量を半定量した。すると、60日齢以下の AppNL-G-F ホモ接合型マウスの血小板は野生型に比べて雌雄いずれにおいても統計的有意に GPD2 蛋白質量が増加していた。また、61日齢以降のものを比較したところ、AppNL-G-Fホモ接合型マウスの GPD2 蛋白質の発現亢進が消失した。従って、脳内にアミロイドβ蓄積する直前に血小板における ATP合成活性の増加は GPD2 蛋白質の発現亢進が少なくとも一部は寄与しているとみられる。
アルツハイマー病早期発見に血球の ATP合成活性測定を利用するため、血小板に分画せず直接全血を用いて G3P による ATP合成を測定することを目指した。性別や16時間飢餓による影響はなかったが、暗期開始直後は ATP合成活性が増加傾向にあった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
アルツハイマー病モデルマウスの脳内にアミロイドβが蓄積する直前に、血小板において G3P を呼吸基質とした ATP合成活性の上昇は GPD2蛋白質の発現が寄与するものと考えられた。210日齢までのサンプル準備に時間を要したが、GPD2酵素本体の発現上昇を確認でき最初のステップとして順調と考えている。
一方、血球の ATP合成活性を測定してアルツハイマー病の発症を予測する手法の開発については想定より進捗が遅れている。その原因は、全血から血漿を取り除いて血球のみを用いて ATP合成を測定しようとすると数値が安定しなかったからである。結果的には、血滴を血液凝固防止剤コートのチューブに直接回収して、血漿を取り除かず希釈して測定することで安定した測定値を得られることがわかった。統計解析には至っていないが、データの集積を行っている。
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| 今後の研究の推進方策 |
アミロイドβが脳内に蓄積する前に、血小板の GPD2蛋白質が発現亢進するのはアミロイドβによる呼吸鎖の阻害が関係すると考えられる。先行研究では、アミロイドβは呼吸鎖 I および IV を阻害することが報告されている。呼吸鎖 I が阻害されてミトコンドリア膜電位が十分に維持できなくなったため、これを補うために GPD2の発現が亢進しているとする仮説を検証する。培養細胞系で人工合成したアミロイドβあるいはロテノンなどの呼吸鎖 I 特異的阻害剤を投与したときの GPD2の変化を調べる。また、アミロイドβにより呼吸鎖が阻害されれば細胞内 ATPレベルの低下が予測されるので、AMPKなどのシグナル伝達系についても調べる。
全血を用いた ATP合成活性測定を継続して、統計的に検証する。次に、AppNL-G-Fヘテロ接合型マウスから採血して血液の ATP合成活性を測定し、1 ~ 2ヶ月後の脳内アミロイドβの蓄積を免疫蛍光で測定する。以上の測定データにより、血液の ATP合成活性から脳内アミロイドβの蓄積が予測可能か否か検証する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
2021年度8月に所属が変わり使用していたアルツハイマー病モデルマウスの作成者に問い合わせた結果、一度マウスの系を閉じて再度、新任地で譲渡依頼することとなった。その為、マウスの全血を用いた ATP合成活性測定のデータがそろわなかった。2021年12月末にマウスの譲渡を受けて、現在必要なマウスを準備している。3月中旬からヘテロ接合体同士の交配を開始しているので、今年度は全血の ATP合成活性測定とともに血小板内 mRNA の解析を伸展させることに使用する計画である。それにより、全血での簡便なアルツハイマー病予測となぜそれが可能なのかというメカニズムの解析を同時に進めて、研究を加速させる。
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