| 研究課題/領域番号 |
21K07355
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| 研究機関 | 日本医療科学大学 |
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研究代表者 |
菅原 佳奈子 日本医療科学大学, 保健医療学部, 助教 (00551087)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | セルロース合成酵素 / バイオフィルム / 膜タンパク質 / 複合体タンパク質 |
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| 研究実績の概要 |
本研究課題では、感染症の難治化の要因であるバイオフィルムの合成機序を明らかにするため、バイオフィルムの主成分であるバクテリアセルロース（BC）の合成機構の解明に取り組んでいる。BCは細菌の細胞膜上に存在するセルロース合成酵素複合体（TC）によって合成されている。本研究ではBC合成機構の中でも特に、（１）合成されたセルロース鎖を菌体外へ排出すると推測されるBcsCサブユニットの立体構造（２）内膜のBcsABによって合成されたセルロース鎖がどのように外膜のBcsCに受け渡され、菌体外へ導かれるのか、の2点に注目して研究を進めている。
これまでの進捗として、まず上記（１）について、BcsCの単離精製のため、酢酸菌ゲノム上のTCを構成するBcsAおよびBcsCサブユニットにタンパク質精製用のアフィニティタグを挿入した。
次に（２）について、内膜のBcsABと外膜のBcsCとの会合状態の解明に取り組んだ。BcsABとBcsCとの会合については、直接の結合と、別の分子を介した結合のいずれであるか分かっていない。TCにはBCの合成や輸送においてメインに機能するサブユニットの他に、機能不明のアクセサリーサブユニットが存在しており、これらがBcsABとBcsCの結合に関与する可能性が高いと考えた。そこでアクセサリーサブユニットであるBcsD、Ccp、CMCaseの3つのタンパク質を組換え発現し、これらのタンパク質同士が会合して複合体を形成するかどうか確認した。ゲルろ過クロマトグラフィーによる分子質量の測定結果から、BcsDとCcpの組み合わせで分子質量の大きい複合体の形成が示された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
主な研究実施場所である所属大学には膜タンパク質の抽出・精製に必要な超遠心機が配備されていない。これまで共同研究先に配備されている超遠心機を使用していたが故障してしまい、更新の目途が立っていない。現在、借用できる施設を当たっているが、タンパク質の精製を一時的に中止せざるを得ず、研究計画全体としても若干の遅れを生じている。超遠心機を借用できる施設が見つかるまでの間に、セルロース合成酵素のサブユニットをコードする酢酸菌のゲノム上にタンパク質精製用のアフィニティタグを挿入する作業を進めている。また、セルロース合成酵素のサブユニットに対する抗体の作製に取り組んでいる。
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| 今後の研究の推進方策 |
「研究実績の概要」に記載したように、（１）セルロース鎖の排出部であるBcsCの構造の取得を目指してBcsCタンパク質の発現・精製を行う。しかしながら、BcsCは非常に分子質量の大きい膜タンパク質であるため、大腸菌などの宿主による異種発現では宿主にストレスがかかり発現量が抑制される、膜タンパク質のミスフォールディングが起こる等の問題が起こると予想される。実際、世界中でTCの研究が行われているにも関わらず、BcsC全長の組換え発現の報告はない。そこで、組換えによる異種発現ではなく、酢酸菌ゲノム上のbcsc遺伝子に相同組換えによりタグ配列を挿入し、タグを利用したアフィニティ精製により構造解析に十分な精製度・量のBcsCを得たいと考えている。
一方、本研究のもう１つのアプローチである（２）BcsABとBcsCの会合状態の解析については順調に進んでおり、今後も計画通り進める。これまでの研究で明らかにしたTCのアクセサリーサブユニット同士であるBcsDとCcpの複合体が、メインのサブユニットであるBcsABやBcsCと会合するかどうか調べる。我々はセルロース合成酵素の各サブユニットに対する抗体を既に作製しているが、加えてアクセサリーサブユニットであるCcpに対する抗体作製を進めている。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
まず物品費について、研究代表者が2021年4月より所属変更したため、研究機関の設備が申請時と異なっている。所属先は大学の新設学科であり、研究に必要な設備がある程度配備される予定であったが、実際には予算の問題のため導入される設備に変更があり、現在再検討中である。次に旅費について、これまで新型コロナウイルス感染症流行のため、海外への学会出張が認められなかった。次年度以降、学会出張が認められる状況になれば国際学会での研究発表のために使用したい。その他の支出について、論文のオープンアクセス費を共同研究者が負担したため、予定した金額を使用しなかった。本項も次年度に繰り越し、次の論文発表で使用する。
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