蛋白増幅法の検出法をベースとした神経変性疾患を鑑別できる新規バイオマーカーの開発

2021 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 21K07417
• 研究機関: 長崎大学
• 研究代表者: 佐藤 克也 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(保健学科), 教授 (70398147)
• 研究期間 (年度): 2021-04-01 – 2024-03-31
• キーワード: 蛋白増幅法の検出法 / 神経変性疾患 / バイオマーカー

研究実績の概要

特有の領域の神経系統が侵され、神経細胞を中心とする様々な退行性変化を呈する疾患群である神経変性疾患は異常蛋白が蓄積する。異常蛋白は蛋白分解酵素で分解されずにミスフォールドタンパク質として凝集を形成する。神経変性疾患の診断は臨床症状と画像診断に依存していたが、髄液を含めた生体材料から異常蛋白を検出する事が可能となれば第3の神経変性疾患の診断法となりえる。2011年よりプリオン病患者で異常蛋白増幅法を成功し、2015年レビー小体病の髄液から異常蛋白増幅法にも成功した。本研究は異常蛋白増幅法を利用し、神経変性疾患患者の生体材料からの神経変性疾患の特異的な異常蛋白の検出を本研究の目的とする。現在まで神経変性疾患の診断法は臨床症状と画像診断のみである。髄液を含めた生体材料から異常蛋白を検出する事が可能となれば第3の神経変性疾患の診断法となりえる。本研究課題は神経変性疾患患者の髄液を含んだ生体材料からの原因物質の検出を目的とする。
2021年度に関してはリコビナント蛋白の精製法の確立にあて、レビー小体存在下と非存在下でのアミロイド形成反応を比較し、異常シヌクレイン検出系を完成させた。つまりαシヌクレインを用いた異常シヌクレインQUIC法を確立した。ヒトシヌクレイン遺伝子のクローニングを行い、大腸菌発現ベクターに組み入れ、大腸菌での大量合成と蛋白精製を行った。種々の条件下でシヌクレイン蛋白の構造変換、アミロイド形成を観察した。レビー小体存在下、非存在下でのアミロイド形成反応を比較し、異常シヌクレイン検出系を完成させた。研究代表者はプリオン病を含む多様な認知症状を呈する神経疾患の髄液検体を5000人分以上保管しており、本検査を当教室にて施行した。感度は75％で特異度は80％であった。

現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

本研究を成功させる上でのキーポイントはリコビナント蛋白の精製とQUICする条件（PH、温度、NaCl濃度）である。まずは2021年リコビナント蛋白の精製法を確立した。
しかしながら2021年新規論文ではシヌクレインQUICにてパーキンソン病と多系統萎縮症にて鑑別することができるという内容があり、次年度に次世代シヌクレインQUICの開発を始める。現在次年度に予定した計画以上に進んでおり、当初予定していた計画よりも進展している。

今後の研究の推進方策

1.リコビナント蛋白の精製法の確立：本研究を成功させる上でキーポイントはリコビナント蛋白の精製とQUICする条件（PH、温度、NaCl濃度）である。2022年でシヌクレイン蛋白以外のリコビナント蛋白の精製法の確立に当てる。
2.TDP-43を用いた異常型TDP-43検出法の確立：ヒトTDP-43遺伝子のクローニングを行い、大腸菌発現ベクターに組み入れる。大腸菌での大量合成と蛋白精製を行う。又TDP-43患者脳をbrain bankより入手し、超遠心法により異常型TDP-43の精製を行う。さらに種々の条件下でTDP-43蛋白の構造変換、アミロイド形成を観察する。TDP-43存在下・非存在下でのアミロイド形成反応を比較し、異常TDP-43検出系を完成する。
3.タウ蛋白を用いた3Rタウ蛋白と4Rタウ蛋白の検出法の確立と鑑別：ヒトタウ遺伝子のクローニングを行い、大腸菌発現ベクターに組み替えを行う。腸菌での大量合成と蛋白精製を行う。精製したヒトタウ蛋白の構造を解析する。3Rタウ検出用のリコンビナント蛋白と4Rタウ検出用のリコンビナント蛋白は構造と蛋白発現が全く異なる。そのため2種類のタウ蛋白の精製が必要である。種々の条件下でタウ蛋白の構造変換、アミロイド形成を観察する。タウ蛋白存在下、非存在下でのアミロイド形成反応を比較し異常化した3Rタウ蛋白と4Rタウ蛋白検出系を完成させる。

次年度使用額が生じた理由

消費税と原価・単価の変動にて18円誤差が生じている。2022年度に繰り越した経費はこの実験の消耗品の購入に充てる予定である。

研究成果

• [雑誌論文] CSF biomarkers for prion diseases (2022)
  • 著者名/発表者名: Satoh Katsuya
  • 雑誌名: Neurochemistry International 巻: 155 ページ: 105306～105306
  • DOI: 10.1016/j.neuint.2022.105306
  • 査読あり
• [雑誌論文] Significance of Cortical Ribboning as a Biomarker in the Prodromal Phase of Sporadic Creutzfeldt-Jakob Disease (2022)
  • 著者名/発表者名: Hamada Yasuhiro、Deguchi Kazushi、Tachi Kisaki、Kita Makoto、Nonaka Wakako、Takata Tadayuki、Kobara Hideki、Touge Tetsuo、Satoh Katsuya、Masaki Tsutomu
  • 雑誌名: Internal Medicine 巻: 2 ページ: 1～4
  • DOI: 10.2169/internalmedicine.8354-21
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Formalin RT-QuIC assay detects prion-seeding activity in formalin-fixed brain samples from sporadic Creutzfeldt-Jakob disease patients (2021)
  • 著者名/発表者名: Dong Thi-Thu-Trang、Akagi Akio、Nonaka Toshiaki、Nakagaki Takehiro、Mihara Ban、Takao Masaki、Iwasaki Yasushi、Nishida Noriyuki、Satoh Katsuya
  • 雑誌名: Neurobiology of Disease 巻: 159 ページ: 105504～105504
  • DOI: 10.1016/j.nbd.2021.105504
  • 査読あり
• [雑誌論文] The Latest Research on RT-QuIC Assays. A Literature Review (2021)
  • 著者名/発表者名: Dong Thi-Thu-Trang、Satoh Katsuya
  • 雑誌名: Pathogens 巻: 10 ページ: 305～305
  • DOI: 10.3390/pathogens10030305
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Biomarkers and diagnostic guidelines for sporadic Creutzfeldt-Jakob disease (2021)
  • 著者名/発表者名: Peter Hermann, Brian Appleby, Jean-Philippe Brandel, Byron Caughey, Steven Collins, Michael D Geschwind, Alison Green, Stephane Haik, Gabor G Kovacs, Anna Ladogana, Franc Llorens, Simon Mead, Noriyuki Nishida, Suvankar Pal, Piero Parchi, Maurizio Pocchiari, Katsuya Satoh, Gianluigi Zanusso, Inga Zerr
  • 雑誌名: The Lancet Neurology 巻: 20 ページ: 235～246
  • DOI: 10.1016/S1474-4422(20)30477-4
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] V180I genetic Creutzfeldt-Jakob disease with cardiac sympathetic nerve denervation masquerading as Parkinson's disease (2021)
  • 著者名/発表者名: Fujita Hiroaki、Ogaki Keitaro、Shiina Tomohiko、Onuma Hiroki、Sakuramoto Hirotaka、Satoh Katsuya、Suzuki Keisuke
  • 雑誌名: Medicine 巻: 100 ページ: e24294～e24294
  • DOI: 10.1097/MD.0000000000024294
  • 査読あり
• [学会発表] プリオン病の腰椎穿刺と脳脊髄液マーカー (2021)
  • 著者名/発表者名: 佐藤 克也
  • 学会等名: 第36回日本老年精神医学会
  • 招待講演
• [学会発表] ヒトプリオン病の患者の髄液中のバイオマーカー解析 (2021)
  • 著者名/発表者名: 赤羽寅彦, 佐藤克也
  • 学会等名: 第40回日本認知症学会学術集会
• [学会発表] 経動脈的な投与による急性脳梗塞に対する骨髄間葉系細胞治療法の確立 (2021)
  • 著者名/発表者名: 佐藤 克也
  • 学会等名: 第64回日本脳循環代謝学会学術集会
  • 招待講演
• [学会発表] プリオン病のup to date (2021)
  • 著者名/発表者名: 佐藤 克也
  • 学会等名: 第25回日本神経感染症学会総会・学術大会
  • 招待講演
• [学会発表] ヒトプリオン病の患者の髄液中のバイオマーカーの解析 (2021)
  • 著者名/発表者名: 佐藤 克也
  • 学会等名: 第62回日本神経学会学術大会
• [備考] 長崎大学 佐藤研究室
  • URL: http://www2.am.nagasaki-u.ac.jp/prion-cjd/