研究課題
特有の領域の神経系統が侵され、神経細胞を中心とする様々な退行性変化を呈する疾患群である神経変性疾患は異常蛋白が蓄積する。異常蛋白は蛋白分解酵素で 分解されずにミスフォールドタンパク質として凝集を形成する。神経変性疾患の診断は臨床症状と画像診断に依存していたが、髄液を含めた生体材料から異常蛋 白を検出する事が可能となれば第3の神経変性疾患の診断法となりえる。2011年よりプリオン病患者で異常蛋白増幅法を成功し、2015年レビー小体病の髄液から 異常蛋白増幅法にも成功した。本研究は異常蛋白増幅法を利用し、神経変性疾患患者の生体材料からの神経変性疾患の特異的な異常蛋白の検出を本研究の目的と する。現在の神経変性疾患の診断法は臨床症状と画像診断のみである。髄液を含めた生体材料から異常蛋白を検出する事が可能となれば第3の神経変性疾患の 診断法となりえる。本研究課題は神経変性疾患患者の生体材料からの原因物質の検出を目的とする。2021年度に関してαシヌクレインQUIC法の感度は75％で特異度は80％であった。2022年度は感度をさらにアップさせる条件検討を行った。リコビナント蛋白の精製法の確立に焦点をあて、レビー小体存在下と非存在下でのアミロイド形成反応を比較し、異常シヌクレイン検出系を完成させた。つまりαシヌクレインを用いた異常シヌクレインQUIC法を確立した。ヒトシヌクレイン遺伝子のクローニングを行い、大腸菌発現ベクターに組み入れ、大腸菌での大量合成と蛋白精製を行った。種々の条件下でシヌクレイン蛋白の構造変換、アミロイド形成を観察した。レビー小体存在下、非存在下でのアミロイド 形成反応を比較し、異常シヌクレイン検出系を完成させた。αシヌクレインQUIC法の感度は98％で特異度は100％であった。
1: 当初の計画以上に進展している
本研究を成功させる上でのキーポイントはリコビナント蛋白の精製とQUICする条件（PH、温度、NaCl濃度）である。2022年度は、リコビナント蛋白の精製法を確立した。次年度に予定した計画であるため、当初予定していた計画よりも進展している。
タウ蛋白を用いた3Rタウ蛋白と4Rタウ蛋白の検出法の確立と鑑別する系を確立する。ヒトタウ遺伝子のクローニングを行い、大腸菌発現ベクターに組み替えを行う。大腸菌での大量合成と蛋白精製を行う。精製したヒトタウ蛋白の構造を解析する。3Rタウ検出用のリコンビナント蛋白と4Rタウ検出用のリコンビナント蛋白は構造と蛋白発現が全く異なる。そのため2種類のタウ蛋白の精製が必要である。種々の条件下でタウ蛋白の構造変換、アミロイド形成を観察する。タウ蛋白存在下、非存在下でのアミロイド形成反応を比較し、異常化した3Rタウ蛋白と4Rタウ蛋白検出系を完成する。
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