| 研究課題/領域番号 |
21K07422
|
|---|
| 研究機関 | 京都府立医科大学 |
|---|
研究代表者 |
渡邊 義久 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (50363990)
|
|---|
| 研究分担者 |
田口 勝敏 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (60462701)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
|
| キーワード | オートファジー / 神経変性疾患 / Beclin1 / Rubicon / UVRAG |
|---|
| 研究実績の概要 |
Becin1複合体形成を指標としたBasal Autophagy活性の測定システムの開発のために、スプリット発光タンパク質NanoBitを利用しタンパク質-タンパク質相互作用解析を行った。HEK293細胞にLgBiT-Beclin1とSmBiT-UVRAG、LgBiT-Beclin1とSmBiT-Rubicon、LgBiT-Beclin1とSmBiT（ネガティブコントロール）の組み合わせで一過的に遺伝子導入を行った。一晩培養した後、発光基質Nano-Glo Live Cell Substrateを加え、マルチモードプレートリーダーGloMaxで発行測定を行った。その結果、すべての組み合わせで発光が認められ、ネガティブコントロールとして使用したLgBiT-Beclin1とSmBiTの組み合わせでも高い発光量であった。従って、本システムではベースの値が高いため目的タンパク質の相互作用を測定するのが非常に困難であった。この問題を解決するために、一過的発現ではなく安定発現株を作製し相互作用解析を行う。現在、本ベクターに薬剤耐性マーカーを導入している。また、コントロールとして使用するATG7_KOおよびRubicon_KO細胞をCRISPR/Cas9で作製した。これらの細胞も利用しオートファジー活性を測定する予定である。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
構築したシステムのネガティブコントロールでも活性が高かったため改良が必要となった。
|
| 今後の研究の推進方策 |
構築したベクターで安定発現株を作製するために、薬剤耐性遺伝子を導入する。そして、これらの細胞で相互作用の測定を行う。また、ATG7_KOやRubicon_KO細胞を作製したので、これらの細胞でも同様に安定発現株を作製し、オートファジー活性と相互作用活性の相関を確認する。
|
