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昨年度作製したATG7とRubiconノックアウト細胞で種々の神経変性疾患モデルを作製した。パーキンソン病モデルとしてα-Synuclein-GFP、アルツハイマー病モデルとしてTau_P301L(RD)-GFPを発現させ、in vitroで作製したα-SynucleinまたはTau(3R) PFFをリポフェクトアミンで導入し、GFPを指標としてフローサイトメーターで凝集体の測定を行った。ATG7 KO細胞ではα-Synuclein-GFPとTau_P301L(RD)-GFPの凝集体形成の促進が確認できた。さらに、迅速にオートファジーFluxを測定するためにGFP-LC3-RFPをレポーターとしてフローサイトメーターで蛍光タンパク質を測定した。ATG7KOやRubicon KO細胞でGFP-LC3-RFPを安定発現させ、リソソーム阻害剤バフィロマイシンA1の処理などを行った後、細胞をトリプシン処理してフローサイトメーターでオートファジー活性を測定した。ダイナミックレンジは狭いが、高い精度でオートファジーfluxを測定することができた。今後、Beclin1やUVRAGなどの過剰発現の影響なども調べる。また、カテプシンLの発現によるオートファジー活性もこのシステムで測定し、過剰発現により有意に活性化することが明らかになった。
オートファジー関連タンパク質の１つであるWDR45とオートファジー活性の関連性を調べた。WDR45遺伝子のノックアウト細胞を作製しオートファジー活性を測定したところ、有意な変化は認められなかった。一方、ミトコンドリアやリソソームの形態を免疫染色で間作したところ、リソソームの凝集化が観察された。
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