| 研究課題/領域番号 |
21K07473
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
大村 優 北海道大学, 医学研究院, 講師 (80597659)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | セロトニン |
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| 研究実績の概要 |
令和3年度の計画は、上記の1.「ゲノム編集によるTPH2ノックアウトの条件検討」に取り組むことであった。ウイルスベクターの脳内投与によってゲノム編集を引き起こす予定であるため、「背側縫線核の大部分でTPH2ノックアウトを引き起こし、かつ他のセロトニン神経起始核にまで漏れない投与量・投与方法」を探索することがまず必要である。いくつかの投与量、投与部位座標を試行し、適切な方法を見出すことに成功した。また、TPH2遺伝子がノックアウトできたことの確認として、シークエンスによるDNA配列の確認、免疫染色によるTPH2タンパク発現消失の確認、HPLC-ECD(電気化学検出高速液体クロマトグラフィー)によるセロトニン量減少の確認、の3つを実施することが計画されていた。シークエンスによるゲノム編集効果は確認でき、オフターゲット効果も調べた限りではなかった。anti-TPH2抗体を用いてTPH2タンパク質発現がウイルスベクター感染部位でのみ見られることも確認された。一方、HPLC-ECDによる確認作業は難航している。まず、所有装置が経年劣化しているため、いくつかの部品を交換し、基礎検討をやり直す必要があった。また、マウスの脳からわずか1mm程度の背側縫線核を回収しなくてはならないが、毎回安定して同じ部位を切り出すことが難しく、5-HTの値がコントロール群ですら安定しない。そのため、現在は脳スライスを切り出して顕微鏡下で背側縫線核を切り出す方法を検討中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の計画の3/4は達成できているため、おおむね順調とみなした。
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| 今後の研究の推進方策 |
マウスの小さな脳から毎回安定して同じ部位を切り出すことが難しく、5-HTの値がコントロール群ですら安定しない。そのため、脳スライスを切り出して顕微鏡下で背側縫線核を切り出す方法を検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初予定したHPLC-ECDによる5-HT減少の確認作業が難航し、基礎検討をやり直すこととなったため。基礎検討完了後、当初予定の目的に残額を使用する。
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