| 研究課題/領域番号 |
21K07548
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| 研究機関 | 熊本大学 |
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研究代表者 |
文東 美紀 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 准教授 (00597221)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | ヒト死後脳 / 発現解析 / ロングリードシーケンサー / LINE-1 / 統合失調症患者 |
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| 研究実績の概要 |
これまで、統合失調症患者試料を使用した遺伝子発現解析は数多く報告されているが、マ
イクロアレイ法やショートリードの次世代シーケンサーを使用した解析がほとんどであり、大規模なゲノムの構造変異の影響を受けた転写産物を検出することは困難であった。近年、次世代シーケンサーの技術の発展に伴い、長鎖RNAをcDNAに逆転写するプロセスなしに、直接シーケンスすることが可能になりつつある。これまでに申請者らは、統合失調症患者死後脳の神経細胞ゲノムにおいて、レトロトランスポゾンLINE-1のコピー数が増幅していること、増幅したLINE-1配列は神経細胞の機能や構造を保持するために重要な遺伝子の近傍に挿入されていることを示した。本研究では、統合失調症患者脳試料を用い、レトロトランスポゾン新規転移などの大規模な構造変異が遺伝子発現に与える影響を、長鎖型シークエンサーを利用したRNAの直接解析により検討する。
本年度は、ヒト神経芽細胞腫由来の培養細胞であるSK-N-SHおよび、健常ヒト死後脳前頭葉から長鎖ｍRNAを効率よく精製する方法の検討を行った。抽出したmRNAを直接シーケンスするために、ロングリードシーケンサーの一つであるNanopore社のDirect RNA sequencingキットを使用し、MINionによるランを行った。現在は得られたデータについて、ヒト参照配列に対するマッピングなどの解析を行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ヒト神経芽細胞腫由来の培養細胞SK-N-SHおよび、健常ヒト死後脳前頭葉から長鎖mRNAを効率よく抽出できる条件を決定し、ロングリードシーケンサーMINionによるデータの取得まで終了している。
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| 今後の研究の推進方策 |
得られたシーケンスデータについて、LINE-1の検出及び、LINE-1挿入に伴うRNAの構造変化を検出するバイオインフォマティクス解析の手法の確立を行う。
手法の確立が終了次第、統合失調症患者死後脳を使用して、RNAシーケンスデータ取得を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
事前に計画していた消耗品費より少額の費用で実験を実施できたため、余剰分が生じた。余剰分は次年度分の助成金と合わせ、これから行うシーケンス費用として使用する。
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