| 研究課題/領域番号 |
21K07660
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| 研究機関 | 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構 |
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研究代表者 |
大島 康宏 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構, 高崎量子応用研究所 放射線生物応用研究部, 主幹研究員 (00588676)
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| 研究分担者 |
坂下 哲哉 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構, 高崎量子応用研究所 放射線生物応用研究部, 上席研究員 (30311377)
横田 裕一郎 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構, 高崎量子応用研究所 放射線生物応用研究部, 主幹研究員 (30391288) [辞退]
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | RI内用療法 / α線 / 211At-MABG / 悪性褐色細胞腫 / Otub1 / 電気穿孔法 |
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| 研究実績の概要 |
α核種を用いたRI内用療法は、全身に転移した難治性がんに高い治療効果をもたらす。しかし、その効果は一様ではなく患者毎に異なる。よって、治療応答を迅速・的確に識別可能なバイオマーカーの発見が切望されている。しかし、有効なバイオマーカーは未だ見つかっていない。我々はこれまでに悪性褐色細胞腫や神経芽細胞腫への治療応用が期待されるα線放出211At標識メタアスタトベンジルグアニジン（211At-MABG）の開発を進め、褐色細胞腫モデルにおいて211At-MABG処置後に特異的に高発現する遺伝子としてOtub1を特定した。これまでに知られているOtub1の分子生物学的機能を考慮すると、Otub1は211At-MABGによるがん治療効果を左右する重要な役割を有すると予想される。しかし、211At-MABG治療に限らず放射線照射によるOtub1発現の生物学的寄与の詳細は不明である。そこで、本研究ではOtub1の新規バイオマーカーとしての可能性を明らかにすることを目的とし、211At-MABG治療におけるOtub1の分子生物学的な役割を追究することとした。
2021年度はOtub1発現抑制法を構築するための検討を進め、電気穿孔法を利用することで、高効率なsiRNA導入が可能であることを見出した。また、Otub1特異的なsiRNAを利用してOtub1発現抑制の最適条件を検討した結果、コントロールと比較してOtub1のmRNA発現を約35～40%まで、タンパク質発現を21.5%まで抑制できる条件を見出した。以上の結果より、2021年度の目標としたPC-12細胞に対するOtub1発現抑制法の構築を達成した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
2021年度の目標とした「Otub1発現誘導抑制系の構築」を達成したことから、予定通りに研究計画は進んでいる。現在までの具体的な進捗状況は以下の通りである。
（１）ハウスキーピング遺伝子であるGAPDHを標的としたsiRNAを利用して、PC-12細胞に対してリポフェクション法によるsiRNA導入条件を検討した。条件を変えながらsiRNA導入を試みたが、GAPDHのmRNA発現抑制は認められなかったため、リポフェクション法ではPC-12細胞へのsiRNA導入が難しいことが分かった。次に、電気穿孔法によるsiRNA導入方法について検討した。文献等を参考にsiRNA導入条件の最適化を行った結果、300V、500μFにおいて最も高効率にGAPDHのmRNA発現を抑制できることを見出した。
（2）Otub1特異的なsiRNAを作製し、Otub1発現抑制の最適条件を検討した結果、siRNA導入から24～48時間後においてOtub1のmRNA発現をコントロールの約35～40%に抑制できた。更に、Otub1タンパク質発現について検討した結果、siRNA導入24時間後においてコントロールの21.5%までOtub1発現を抑制できた。siRNAの持続時間を検討した結果、Otub1タンパク質発現はsiRNA導入24時間後をピークとして減少し、その後徐々に回復することが分かった。以上の結果から、211At-MABG処置のタイミングはsiRNA導入から24時間以内に実施することが必要であることが分かった。
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| 今後の研究の推進方策 |
研究計画に従い、本年度以降は211At-MABGの細胞障害効果に対するOtub1発現抑制の影響について検討し、Otub1依存的な細胞内シグナル応答解析を進める。具体的には、野生型（PC12-WT）、Mock-siRNA導入細胞（PC12-Mock）及びOtub1-siRNA導入細胞（PC12-Otub1-KD）において、211At-MABG処置後の細胞生存率や細胞死、DNA二重鎖切断及び細胞周期等を検討し、211At-MABGによる細胞障害効果に対するOtub1発現の影響を調べる。Otub1発現抑制により211At-MABGの細胞障害効果が亢進した場合、Otub1の治療抵抗性への関与が予想されるため、RASやFOXM1下流の細胞内シグナルを調べる。Otub1発現抑制により211At-MABGの細胞障害効果が抑制された場合は、Otub1の細胞死への関与が見込まれるため、DNA修復阻害、p53、MDM2、MDMX下流のシグナル応答を解析する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
（理由）研究費申請額に比べ研究費交付額が減額されたため、2021年度の必要消耗品への予算配分を考慮した結果、購入予定としていた設備備品等の購入を断念したため、次年度使用額が生じた。
（使用計画）本研究計画の達成に向け、2022年度以降はMABG合成用試薬やOtub1発現抑制のためのsiRNA、タンパク質発現解析用試薬等を購入予定である。また、細胞生存率や細胞死、DNA二重鎖切断及び細胞周期等を検討するための試薬も購入予定である。更に、本研究成果については学会発表及び英文誌への投稿を予定しており、その参加費、旅費、雑誌投稿のための英文校閲費、雑誌投稿料に充当する予定である。
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