| 研究課題/領域番号 |
21K07763
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| 研究機関 | 久留米大学 |
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研究代表者 |
原 好勇 久留米大学, 医学部, 准教授 (40309753)
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| 研究分担者 |
柏木 孝仁 久留米大学, 医学部, 准教授 (70320158)
渡邊 浩 久留米大学, 医学部, 教授 (90295080)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | パラミクソウイルス / 抗ウイルス薬 / RNAポリメラーゼ / Pタンパク質 |
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| 研究実績の概要 |
パラミクソウイルス感染症は麻疹、RSウイルス感染症、ムンプスなど幼児にとって脅威的な感染症が多く含まれているが、未だ特異的な抗ウイルス薬が開発されていない。そこで本研究では、我々が作製した抗RSウイルス活性をもつペプチドベース阻害薬「PFr」を基盤に、各種パラミクソウイルスに幅広く効果を発揮する阻害薬の開発を目標としている。
初年度は「PFr」の改良を行った。「PFr」はウイルスのPタンパク質の機能部位を元に設計しており、Pタンパク質に結合しウイルスRNAポリメラーゼの活性を阻害する。これまでの「PFr」はC末端にタンデムアフィニティータグ（TAPタグ）を付加し組換えバキュロウイルス発現系を用いて精製してきた。しかし、C末端にTAPタグを付加すると、最終精製物（127アミノ酸長）のC末端にはTAPタグに由来する46個ものアミノ酸が残存していた。「PFr」のC末端はRNAポリメラーゼと結合する重要な部位であり、そこが露出していないと抗ウイルス活性が100％発揮できない恐れがある。さらに、余剰のアミノ酸により「PFr」全体の分子サイズが大きくなり細胞への取り込み効率が悪くなっている可能性がある。そこでこれらの問題を解決するため、TAPタグを「PFr」のN末端に移動させC末端を露出させ、かつ最終精製時にTAPタグの残存アミノ酸をゼロに近づけることを目指した。TAPタグを「PFr」のN末端に直結した場合、TEVプロテアーゼが作用できず精製できなかった。しかし、TAPタグと「PFr」の間にリンカーとなるアミノ酸数個を挿入すると精製が可能となった。最終的に、N末端に7個のリンカーアミノ酸が付加したC末端露出型の「PFr」を作製することができた。全体の分子サイズも127→88アミノ酸長へと大幅に小さくすることができた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
TAPタグをN末端へ移動させる際、TEVプロテアーゼがうまく作用せず「PFr」が精製できないという困難が生じ、「PFr」の改良に時間を要した。しかし、リンカーアミノ酸を挿入することで問題を解決し、最終的にC末端露出型の「PFr」を作製することができた。精製純度および精製量も改良前の「PFr」と同等であった。今回作製した「PFr」発現用プラスミドは、他パラミクソウイルスの「PFr」を作製する際のベースに使用する予定である。また、学会での成果発表は新型コロナウイルス感染症の影響で見送った。
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| 今後の研究の推進方策 |
改良型「PFr」のRSウイルスに対する阻害効果の基礎データを集積し、改良前の「PFr」と抗ウイルス活性を比較する。またC末端を露出させたことでウイルスのRNAポリメラーゼにも作用できるようになったのか検証する。さらにRSウイルス以外のパラミクソウイルスに対する抗ウイルス活性を調べる。最初にRSウイルスに近縁なメタニューモウイルス、次に遺伝的に距離のあるパラインフルエンザウイルスについて検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
理由：「PFr」の改良に時間を要したため、実験計画の次の段階へ進むことができなかった。また学会発表を見送った等の理由により未使用額が生じた。
使用計画：次の段階の実験経費に充てる計画である。
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