周産期大脳神経細胞に特異的なサイトメガロウイルス持続感染と脳障害発生機構の解析

2021 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 21K07816
• 研究機関: 浜松医科大学
• 研究代表者: 小杉 伊三夫 浜松医科大学, 医学部, 准教授 (10252173)
• 研究期間 (年度): 2021-04-01 – 2024-03-31
• キーワード: サイトメガロウイルス / 脳発達障害 / 周産期 / 神経細胞特異的エンハンサー / e1-プロモーター

研究実績の概要

MCMV-e1-proにおいて転写開始点からnt -172までがMCMV-IE3結合によるe1-pro活性化に必須とされている．しかし，nt -1000までにIE3結合モチーフが35個存在していることから，これらの結合モチーフがIE3結合によるe1-pro活性化にどの程度関与するかについて検討を行った．転写開始点から，nt -943, nt -839, nt -556, nt -449, nt -193までのe1-pro領域を欠損したe1-proレポータープラスミド，p-e1proΔ943-EGFP, p-e1proΔ839-EGFP, p-e1proΔ556-EGFP, p-e1proΔ449-EGFP, p-e1proΔ193-EGFPを作成した．これらのプラスミドをpcDNA-MCMV-ie3と共にHEK293T細胞に導入し，EGFP発現を比較した．その結果，p-e1proΔ943-EGFP, p-e1proΔ839-EGFP導入細胞では，EGFP発現は極僅かであった．しかし，p-e1proΔ556-EGFP導入細胞で急激な発現増を認め，p-e1proΔ449-EGFP, p-e1proΔ193-EGFPでは暫時発現が増強していった．従って，nt -839までの上流域に存在するIE3結合モチーフもe1-pro活性化に関与し得ることが明らかとなった．このことからnt -449からnt -1373に存在する神経細胞特異的エンハンサーの作用にIE3の結合が関わると推測された．

現在までの達成度 (区分)

4: 遅れている

理由

MCMV-e1プロモーター領域に変異を導入した遺伝子組替えMCMVの作成に時間を要している．

今後の研究の推進方策

1.MCMV e1-enhancerにおける神経細胞特異的なe1-pro活性化に関わる領域の特定
1e1-enhancer領域(925nt: 161605-162529: gene accession number U68299)を長さ400~500ntの左右2区域に分割し、PCR法によって増幅する。 各々のDNA配列を、e1-pro-448を含む基本トランスファープラスミド(pMCMV-e1-pro448)のプロモーター直上に組込んで、組換え用トランスファープラスミド(pMCMV-e1-enhancer-Lt or -Rt/pro448)を作製する。
2上記pMCMV-e1-enhancer-Lt or -Rt/pro448から相同組換え用DNA配列を切 り出しMCMV野生株(Smith株)が感染したマウスNIH3T3細胞に導入し、相同組換え法によって2種類の組換えMCMV(rMCMV)を作製する。
3上記rMCMVを初代培養マウス大脳神経細胞及びマウス新生仔大脳に感染させ、rMCMV1373・rMCMV448感染細胞と比較し前者と同様にEGFPを発現するe1-short enhancer領域を確定する。
4確定されたe1-short enhancer領域を2分割し、上記1)-3)と同様の方法で神経細胞特異的に活性化する領域を 絞り込む。5CRSPR-CAS9による遺伝子編集技術を用いて上記で同定された神経細胞特異的に活性化する領域を欠失したrMCMVを作製する。初代 培養神経細胞及び新生仔大脳における同ウイルスの感染性について検討する。

次年度使用額が生じた理由

遺伝子組替えMCMVの設計に時間を要したことから，実際に作成するための研究費を年度内に使用できなかった．従って，作成に必要な高額な消耗品費を次年度に繰り越すことにした．

研究成果

• [雑誌論文] Prolonged activation of cytomegalovirus early gene e1-promoter exclusively in neurons during infection of the developing cerebrum (2021)
  • 著者名/発表者名: Kosugi I, Arai Y, Baba S, Kawasaki H, Iwashita T, Tsutsui Y
  • 雑誌名: Acta Neuropathol Commun 巻: 9 ページ: 39
  • DOI: 10.1186/s40478-021-01139-0
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Prohibitin-1 Contributes to Cell-to-Cell Transmission of Herpes Simplex Virus 1 via the MAPK/ERK Signaling Pathway (2021)
  • 著者名/発表者名: Watanabe M, Arii J, Takeshima K, Fukui A, Shimojima M, Kozuka-Hata H, Oyama M, Minamitani T, Yasui T, Kubota Y, Takekawa M, Kosugi I, Maruzuru Y, Koyanagi N, Kato A, Mori Y, Kawaguchi Y
  • 雑誌名: J Virol 巻: 95 ページ: e01413-20
  • DOI: 10.1128/JVI.01413-20
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Prevalence of UL97 gene mutations and polymorphisms in cytomegalovirus infection in the colon associated with or without ulcerative colitis (2021)
  • 著者名/発表者名: Tamura S, Osawa S, Ishida N, Miyazu T, Tani S, Yamade M, Iwaizumi M, Hamaya Y, Kosugi I, Furuta T, Sugimoto K
  • 雑誌名: Sci Rep 巻: 11 ページ: 13676
  • DOI: 10.1038/s41598-021-93168-x
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Diagnosis of Ion-Exchange Resin Depositions in Paraffin Sections Using Corrective Light and Electron Microscopy-NanoSuit Method (2021)
  • 著者名/発表者名: Ooishi M, Yamada S, Itoh T, Meguro S, Yagi H, Kosugi I, Iwashita T, Shinmura K, Misawa K, Hariyama T, Kawasaki H
  • 雑誌名: Diagnostics (Basel) 巻: 11 ページ: 1193
  • DOI: 10.3390/diagnostics11071193
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Difference in the distribution of tumor-infiltrating CD8+ T cells and FOXP3+ T cells between micronodular thymoma with lymphoid stroma and micronodular thymic carcinoma with lymphoid stroma (2021)
  • 著者名/発表者名: Yagi H, Nakaguro M, Ito M, Okumura Y, Takahashi S, Aoshima Y, Enomoto Y, Meguro S, Kawasaki H, Kosugi I, Shimoyama Y, Ogawa H, Tateyama H, Iwashita T
  • 雑誌名: Pathol Int 巻: 71 ページ: 453-462
  • DOI: 10.1111/pin.13099
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Differential Diagnosis of Idiopathic Pulmonary Fibrosis Versus Other Interstitial Lung Diseases: A Clinical and Pathophysiological Analysis (2021)
  • 著者名/発表者名: Aoshima Y, Enomoto Y, Muto S, Meguro S, Kawasaki H, Kosugi I, Fujisawa T, Enomoto N, Inui N, Nakamura Y, Suda T, Iwashita T
  • 雑誌名: Lung 巻: 199 ページ: 289-298
  • DOI: 10.1007/s00408-021-00440-y
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Behcet's Disease with Bilateral Renal Infarction Due to Mucormycosis (2021)
  • 著者名/発表者名: Shimoyama K, Niwa T, Furukawa S, Morishita N, Nagakura Y, Yonezawa H, Hatakeyama M, Okubo Y, Suzuki D, Kosugi I, Shiogama K, Ogawa N
  • 雑誌名: Intern Med 巻: 61 ページ: 1077-1083
  • DOI: 10.2169/internalmedicine.7462-21
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Metformin reduces pleural fibroelastosis by inhibition of extracellular matrix production induced by CD90-positive myofibroblasts (2021)
  • 著者名/発表者名: Aoshima Y, Enomoto Y, Fukada A, Kurita Y, Matsushima S, Meguro S, Kosugi I, Kawasaki H, Katsura H, Fujisawa T, Enomoto N, Nakamura Y, Inui N, Suda T, Iwashita T
  • 雑誌名: Am J Transl Res 巻: 13 ページ: 12318-12337
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] 先天性サイトメガロウイルス中枢感染:特集・先天サイトメガロウイルス感染と難聴―診断・予防・治療 ― (2021)
  • 著者名/発表者名: 小杉伊三夫
  • 雑誌名: Monthly Book ENTONI 巻: 261 ページ: 12-17
• [学会発表] 周産期大脳神経細胞に特異的なサイトメガロウイルス持続感染の解析 (2021)
  • 著者名/発表者名: 小杉伊三夫
  • 学会等名: 第68回日本ウイルス学会学術集会
• [学会発表] 周産期大脳神経細胞に特異的なサイトメガロウイルス持続感染の解析 (2021)
  • 著者名/発表者名: 小杉伊三夫
  • 学会等名: 第34回ヘルペスウイルス研究会
• [学会発表] 周産期大脳神経細胞に特異的なサイトメガロウイルス早期遺伝子(e1)プロモーター活性化機構 (2021)
  • 著者名/発表者名: 小杉伊三夫
  • 学会等名: 第110回日本病理学会総会