周産期大脳神経細胞に特異的なサイトメガロウイルス持続感染と脳障害発生機構の解析

2022 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 21K07816
• 研究機関: 浜松医科大学
• 研究代表者: 小杉 伊三夫 浜松医科大学, 医学部, 准教授 (10252173)
• 研究期間 (年度): 2021-04-01 – 2024-03-31
• キーワード: サイトメガロウイルス / 脳発達障害 / 周産期 / 神経細胞特異的エンハンサー / e1-プロモーター

研究実績の概要

21年度までの実績：MCMV-e1-proにおいて転写開始点からnt -172までがMCMV-IE3結合によるe1-pro活性化に必須とされている．しかし，nt -1000までにIE3結合モチーフが35個存在していることから，これらの結合モチーフがIE3結合によるe1-pro活性化にどの程度関与するかについて検討を行った．転写開始点から，nt -943, nt -839, nt -556, nt -449, nt -193までのe1-pro領域を欠損したe1-proレポータープラスミド，p-e1proΔ943-EGFP, p-e1proΔ839-EGFP, p-e1proΔ556-EGFP, p-e1proΔ449-EGFP, p-e1proΔ193-EGFPを作成した．
22年度実績：上記のプラスミドをpcDNA-MCMV-ie3と共にHEK293T細胞に導入し，EGFP発現を比較した．その結果，p-e1proΔ943-EGFP, p-e1proΔ839-EGFP導入細胞では，EGFP発現は極僅かであった．しかし，p-e1proΔ556-EGFP導入細胞で急激な発現増を認め，p-e1proΔ449-EGFP, p-e1proΔ193-EGFPでは暫時発現が増強していった．従って，nt -839までの上流域に存在するIE3結合モチーフもe1-pro活性化に関与し得ることが明らかとなった．このことからnt -449からnt -1373に存在する神経細胞特異的エンハンサーの作用にIE3の結合が関わると推測された．また，核移行シグナルの付いたAcGFP1を組み込んだMCMV作製を試みた．具体的にはpLtRt(NheI-)-e1pro1.4-EGFPをNheI/EcoRV Diggestionして，PCR増幅したAcGFP1-NucをNheI/EcoRV siteに組み込んで，pLtRt(NheI-)-e1pro1.4-AcGFP1-Nucを作製した．このトランスファープラスミドから相同組み換え用カセットを切り出し，相同組み換えによって，rMCMV-1373-nucとrMCMV-448-nucを作製することができた．

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

MCMV-e1プロモーター領域に変異を導入した遺伝子組替えMCMVの作成に時間を要している.

今後の研究の推進方策

1.MCMV e1-enhancerにおける神経細胞特異的なe1-pro活性化に関わる領域の特定
1e1-enhancer領域(925nt: 161605-162529: gene accession number U68299)を長さ400~500ntの左右2区域に分割し、PCR法によって増幅する。 各々のDNA配列 を、e1-pro-448を含む基本トランスファープラスミド(pMCMV-e1-pro448)のプロモーター直上に組込んで、組換え用トランスファープラスミド(pMCMV-e1- enhancer-Lt or -Rt/pro448)を作製する。
2上記pMCMV-e1-enhancer-Lt or -Rt/pro448から相同組換え用DNA配列を切 り出しMCMV野生株(Smith株)が感染したマウスNIH3T3細胞に導入し、相同組換え法に よって2種類の組換えMCMV(rMCMV)を作製する。 3上記rMCMVを初代培養マウス大脳神経細胞及びマウス新生仔大脳に感染させ、rMCMV1373・rMCMV448感染細胞と比較し前者と同様にEGFPを発現するe1-short enhancer領域を確定する。
4確定されたe1-short enhancer領域を2分割し、上記1)-3)と同様の方法で神経細胞特異的に活性化する領域を 絞り込む。5CRSPR-CAS9による遺伝子編集技術を用 いて上記で同定された神経細胞特異的に活性化する領域を欠失したrMCMVを作製する。初代 培養神経細胞及び新生仔大脳における同ウイルスの感染性について検 討する。

次年度使用額が生じた理由

遺伝子組替えMCMVの設計に時間を要したことから，実際に作成するための研究費を年度内に使用できなかった.従って，作成に必要な高額な消耗品費を次年度に 繰り越すことにした.

研究成果

• [雑誌論文] Identifying Active Progeny Virus Particles in Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Sections Using Correlative Light and Scanning Electron Microscopy (2023)
  • 著者名/発表者名: Itoh T, Yamada S, Ohta I, Meguro S, Kosugi I, Iwashita T, Itoh H, Kanayama N, Okudela K, Sugimura H, Misawa K, Hariyama T, Kawasaki H
  • 雑誌名: Lab Invest 巻: 103 ページ: 100020
  • DOI: 10.1016/j.labinv.2022.100020
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] A Case of Pulmonary Tumor Thrombotic Microangiopathy Caused by Metastatic Ovarian Cancer: An Antemortem Diagnosis with Pulmonary Aspiration Cytopathology (2023)
  • 著者名/発表者名: Unno K, Ohtani H, Sakamoto A, Murakami H, Yagi H, Ito H, Baba S, Iwashita T, Kosugi I, Maekawa Y
  • 雑誌名: Intern Med 巻: 1641-23 ページ: 1641-23
  • DOI: 10.2169/internalmedicine
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] An autopsy case of ovarian mucinous cystic tumor complicated by ovarian abscess and a review of the English literature (2022)
  • 著者名/発表者名: Suzuki D, Meguro S, Inagaki K, Hashimoto M, Kawasaki H, Kosugi I, Enomoto Y, Sugiyama M, Fukushima M, Iwashita T
  • 雑誌名: Clin Case Rep 巻: 10 ページ: e6507
  • DOI: 10.1002/ccr3.6507
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] The potential of a universal influenza virus-like particle vaccine expressing a chimeric cytokine (2022)
  • 著者名/発表者名: Nerome K, Imagawa T, Sugita S, Arasaki Y, Maegawa K, Kawasaki K, Tanaka T, Watanabe S, Nishimura H, Suzuki T, Kuroda K, Kosugi I, Kajiura Z
  • 雑誌名: Life Sci Alliance 巻: 6 ページ: e202201548
  • DOI: 10.26508/lsa.202201548
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Behet's Disease with Bilateral Renal Infarction Due to Mucormycosis (2022)
  • 著者名/発表者名: Shimoyama K, Niwa T, Furukawa S, Morishita N, Nagakura Y, Yonezawa H, Hatakeyama M, Okubo Y, Suzuki D, Kosugi I, Shiogama K, Ogawa N
  • 雑誌名: Intern Med 巻: 61 ページ: 7462-21
  • DOI: 10.2169/internalmedicine.7462-21
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] 大動脈粥状硬化病変におけるサイトメガロウイルス潜伏感染の病理組織学的解析 (2022)
  • 著者名/発表者名: 小杉伊三夫 他
  • 学会等名: 第111回 日本病理学会総会（神戸）
• [学会発表] 大動脈粥状硬化病変におけるヒトサイトメガロウイルス潜伏感染の病理組織学的解析 (2022)
  • 著者名/発表者名: 小杉伊三夫 他
  • 学会等名: 第69回 日本ウイルス学会学術集会（長崎）