周産期大脳神経細胞に特異的なサイトメガロウイルス持続感染と脳障害発生機構の解析

2023 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 21K07816
• 研究機関: 浜松医科大学
• 研究代表者: 小杉 伊三夫 浜松医科大学, 医学部, 准教授 (10252173)
• 研究期間 (年度): 2021-04-01 – 2025-03-31
• キーワード: サイトメガロウイルス / 脳発達障害 / 周産期 / 神経細胞特異的エンハンサー / e1-プロモーター

研究実績の概要

22年度までの実績：転写開始点から，nt -943, nt -839, nt -556, nt -449, nt -193までのe1-pro領域を欠損したe1-proレポータープラスミド，p-e1proΔ943-EGFP, p-e1proΔ839-EGFP, p-e1proΔ556-EGFP, p-e1proΔ449-EGFP, p-e1proΔ193-EGFPを作成した．その結果，e1Pro領域のnt -449からnt -1373に神経細胞特異的エンハンサーが存在し，この活性化にIE3の結合が関わると推測された．また，核移行シグナルの付いたAcGFP1を組み込んだMCMV作製を試みた．具体的にはpLtRt(NheI-)-e1pro1.4-EGFPをNheI/EcoRV Digestionして，PCR増幅したAcGFP1-NucをNheI/EcoRV siteに組み込んで，pLtRt(NheI-)-e1pro1.4-AcGFP1-Nucを作製した．このトランスファープラスミドから相同組み換え用カセットを切り出し，相同組み換えによって，rMCMV-1373-nucとrMCMV-448-nucを作製した．
23年度実績
上記の結果から，MCMV-e1-pro領域で，転写開始点に対してnt -1373 もしくは -448 から + 38の配列を挿入したe1-pro-1373-EGFP-SV40polyA及びe1-pro-448-EGFP-SV40polyAカセットを作製した(各々のカセットの両端には相同組換えに必要な約1kbpのflanking配列を含む)．後者はIE3がe1-proを活性化するのに必要最小限の領域を含むが，前者はこの必須領域に加え推定される神経細胞特異的なエンハンサー領域を含む．それぞれのカセットをMCMV感染した線維芽細胞にFugene 6を用いたリポフェクションを行うことで，相同組換えを行った．この結果e1-pro活性化がEGFP発現で認識できる遺伝子組換えウイルス，rMCMV1373とrMCMV448を作製することができた．また，同様の方法で，バクテリオファージのCreリコンビナーゼをMCMVゲノムに組込んだrMCMV-Creも作製した．

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

MCMV-e1プロモーター領域に変異を導入した遺伝子組替えMCMVの作成に時間を要している.

今後の研究の推進方策

1.MCMV e1-enhancerにおける神経細胞特異的なe1-pro活性化に関わる領域の特定
1e1-enhancer領域(925nt: 161605-162529: gene accession number U68299)を長さ400~500ntの左右2区域に分割し、PCR法によって増幅する。 各々のDNA配列 を、e1-pro-448を含む基本トランスファープラスミド(pMCMV-e1-pro448)のプロモーター直上に組込んで、組換え用トランスファープラスミド(pMCMV-e1- enhancer-Lt or -Rt/pro448)を作製する。
2上記pMCMV-e1-enhancer-Lt or -Rt/pro448から相同組換え用DNA配列を切 り出しMCMV野生株(Smith株)が感染したマウスNIH3T3細胞に導入し、相同組換え法に よって2種類の組換えMCMV(rMCMV)を作製する。 3上記rMCMVを初代培養マウス大脳神経細胞及びマウス新生仔大脳に感染させ、rMCMV1373・rMCMV448感染細胞と比 較し前者と同様にEGFPを発現するe1-short enhancer領域を確定する。
4確定されたe1-short enhancer領域を2分割し、上記1)-3)と同様の方法で神経細胞特異的に活性化する領域を 絞り込む。5CRSPR-CAS9による遺伝子編集技術を用 いて上記で同定された神経細胞特異的に活性化する領域を欠失したrMCMVを作製する。初代 培養神経細胞及び新生仔大脳における同ウイルスの感染性について検 討する。

次年度使用額が生じた理由

遺伝子組替えMCMVの設計に時間を要したことから，実際に作成するための研究費を年度内に使用できなかった.従って，作成に必要な高額な消耗品費を次年度に 繰り越すことにした.

研究成果

• [雑誌論文] Human induced pluripotent stem cells are resistant to human cytomegalovirus infection primarily at the attachment level due to the reduced expression of cell-surface heparan sulfate (2024)
  • 著者名/発表者名: Kawasaki H, Hariyama T, Kosugi I, Meguro S, Iwata F, Shimizu K, Magata Y, Iwashita T
  • 雑誌名: J Virol 巻: 98 ページ: e0127823
  • DOI: 10.1128/jvi.01278-23
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Pulmonary Tumor Thrombotic Microangiopathy Caused by Metastatic Ovarian Cancer: An Antemortem Diagnosis with Pulmonary Aspiration Cytopathology (2023)
  • 著者名/発表者名: Unno K, Ohtani H, Sakamoto A, Murakami H, Yagi H, Ito H, Baba S, Iwashita T, Kosugi I, Maekawa Y
  • 雑誌名: Intern Med 巻: 62 ページ: 1641-23
  • DOI: 10.2169/internalmedicine.1641-23
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] An autopsy case of disseminated carcinomatosis of the bone marrow from esophageal adenocarcinoma (2023)
  • 著者名/発表者名: Suzuki D, Meguro S, Furusawa S, Hashimoto N, Kawasaki H, Kosugi I, Enomoto Y, Fujihiro M, Tsukui H, Iwashita T
  • 雑誌名: Clin Case Rep 巻: 11 ページ: e7877
  • DOI: 10.1002/ccr3.7877
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Accurate deep learning model using semi-supervised learning and Noisy Student for cervical cancer screening in low magnification images (2023)
  • 著者名/発表者名: Kurita Y, Meguro S, Tsuyama N, Kosugi I, Enomoto Y, Kawasaki H, Uemura T, Kimura M, Iwashita T
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 18 ページ: e0285996
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0285996
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Retrospective immunohistochemical analysis of human cytomegalovirus infection in the placenta and its association with fetal growth restriction (2023)
  • 著者名/発表者名: Funato Y, Higashimoto Y, Kawamura Y, Sakabe Y, Iwakura M, Ihira M, Shiogama K, Miyata M, Nishizawa H, Sekiya T, Fujii T, Kosugi I, Yoshikawa T
  • 雑誌名: Fujita Med J 巻: 9 ページ: 90-94
  • DOI: 10.20407/fmj.2022-001
  • 査読あり
• [雑誌論文] Identifying Active Progeny Virus Particles in Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Sections Using Correlative Light and Scanning Electron Microscopy (2023)
  • 著者名/発表者名: Itoh T, Yamada S, Ohta I, Meguro S, Kosugi I, Iwashita T, Itoh H, Kanayama N, Okudela K, Sugimura H, Misawa K, Hariyama T, Kawasaki H
  • 雑誌名: Lab Invest 巻: 103 ページ: 100020
  • DOI: 10.1016/j.labinv.2022.100020
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] 大動脈粥状硬化病変の平滑筋細胞におけるサイトメガロウイルス潜伏感染の病理組織学的解析 (2023)
  • 著者名/発表者名: 小杉伊三夫、河崎秀陽、岩下寿秀
  • 学会等名: 第70回日本ウイルス学会学術集会
• [学会発表] 大動脈粥状硬化病変の平滑筋細胞におけるサイトメガロウイルス潜伏感染の病理組織学的解析 (2023)
  • 著者名/発表者名: 小杉伊三夫、河崎秀陽、榎本泰典、目黒史織、岩下寿秀
  • 学会等名: 第112回日本病理学会総会