| 研究課題/領域番号 |
21K07870
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| 研究機関 | 自治医科大学 |
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研究代表者 |
阿部 朋行 自治医科大学, 医学部, 講師 (20610364)
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| 研究分担者 |
遠藤 仁司 自治医科大学, 医学部, 教授 (50221817)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 疾患iPS細胞 / ピルビン酸脱水素酵素複合体欠損症 / X染色体再活性化 / 神経分化 |
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| 研究実績の概要 |
疾患iPS細胞は、希少・難治性疾患の病態解析や新薬/根治療法を開発するための極めて強力なプラットホームである。ピルビン酸脱水素酵素複合体（PDHC）欠損症は、エネルギー産生障害を軸とした先天性代謝異常をきたす希少指定難病であり、Leigh脳症の原因の１つである。本症では脳筋症状を示し、軽症例の一部を除いて有効な治療法がない。分担研究者の遠藤は、PDHC欠損症患者から細胞を培養し、初めて変異遺伝子を同定した（Am J Hum Genet, 1989）。また代表研究者の阿部は、健常人iPS細胞を作製して動物体内で分化させる技術を開発した（Exp Hematol, 2022）。これらの技術や材料を活かして本研究では、PDHC欠損症患者由来の凍結保存細胞からiPS細胞を樹立する。当該iPS細胞をエネルギー要求性の高い系統へ分化させることで、病態を再現し、PDHC欠損症に対する薬剤の体外スクリーニング・生体内評価システムを開発する。本研究により、PDHC欠損症の病態解明や治療薬探索の礎となることが期待される。
初年度は、PDHC患者２名に由来する線維芽細胞またはB細胞からそれぞれiPS細胞を作成することに成功した。いずれのiPS細胞もNANOGやSSEA4などの未分化マーカーを発現していたが、PDH遺伝子の変異型アリルは発現せずに正常型アリルのみを発現していた。PDH遺伝子はX染色体上に位置しており、これらのiPS細胞は変異型アリルを発現するX染色体が不活化されていることが原因と考えられた。そこで、培養環境を変えることで高度な未分化状態へと誘導し、X染色体を再活性化させることを試みた。その結果、変異型アリルを発現するiPS細胞の獲得に成功した。次に、変異型または正常型アリルを発現するiPS細胞それぞれを別にサブクローニングし、神経系へ分化誘導させることを試みる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
計画書の令和３年度マイルストーンに記載した通り、長期保存した患者由来細胞を融解培養し、初期化因子を搭載したセンダイウイルスベクターを用いて患者由来線維芽細胞またはリンパ球からiPS細胞の樹立に成功した。異常な遺伝子が不活化していたが、X染色体の再活性化処理を行うことで、両方の遺伝子を発現するiPS細胞を作成することができている。
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| 今後の研究の推進方策 |
試験管内評価として、作製したiPS細胞をエネルギー産生が特に活発な筋肉系や神経系に分化させることで、PDHC欠損症の主症状であるエネルギー不足ならびに乳酸蓄積といった代謝異常状態を再現する。筋肉系分化は京都大学iPS細胞研究所の櫻井博士らの方法（Zhao M et al., Stem Cell Reports 2020）に準じ、神経系分化は慶應大学の岡野博士らの方法（Matsumoto, Stem Cell Reports 2016）に準じる。MyoDやPax7、MHC等を分化マーカーとして、遺伝子発現やタンパク質発現を解析することで評価する。健常人のiPS細胞をコントロールに用いる。エネルギー代謝活性の評価として、細胞外フラックスアナライザーやマイトトラッカー染色によるミトコンドリア呼吸や解糖系を評価する。
また動物体内評価として、筋細胞の障害を促進する骨格筋特異的なミトコンドリアタンパク質遺伝子のコンディショナルノックアウトマウス、あるいはカルディオトキシンを投与して筋損傷を誘導した免疫不全マウスの筋障害部位に、PDHC欠損iPS細胞由来の筋芽細胞を生着させ、動物体内でPDHC欠損症状を再現する。iPS細胞由来筋細胞を生着したマウスに対して、トレッドミルなどで運動負荷をかけ、生着した細胞におけるエネルギー産生能や乳酸の蓄積を評価する。健常人のiPS細胞をコントロールに用いる。iPS細胞を生着した筋組織に対して、組織の一般形態の評価やマイトトラッカーなどによるエネルギー代謝活性の評価を行い、血液中または組織中の乳酸濃度やピルビン酸濃度を生化学検査で評価する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初使用予定だった患者由来凍結細胞のうち複数本は融解しても細胞が生存しなかった。このため、樹立予定だったiPS細胞の株数が減ってしまった。この影響により、細胞の樹立や維持、評価にかかる消耗品が減ったため、次年度繰越額が生じたと考えられる。変異型ならびに正常型遺伝子それぞれの発現を有する細胞株を複数サブクローニングしており、コントロールとして健常人iPS細胞を並行して試験管内評価や動物体内評価に用いることから、次年度使用額を合わせた状態で満額の使用を予定している。
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