非ウイルス性肝疾患でのオートファジーならびに封入体形成の意義

2021 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 21K07926
• 研究機関: 産業医科大学
• 研究代表者: 原田 大 産業医科大学, 医学部, 教授 (00241175)
• 研究期間 (年度): 2021-04-01 – 2024-03-31
• キーワード: オートファジー / プロテアソーム / Mallory-Denk体 / p62 / Hippo-YAP経路 / ストレス顆粒

研究実績の概要

慢性の肝障害が持続するとその頻度には差があるものの原因に関わらず、肝硬変、肝不全ならびに肝癌に進行するおそれがある。慢性ウイルス性肝炎 (B型肝炎とC型肝炎)の治療の進歩により肝疾患診療においてアルコール性肝障害、非アルコール性脂肪性肝疾患 (NAFLD)、ウイルソン病やヘモクロマトーシスのような代謝性肝疾患が注目されている。これらの疾患の重症例の病理所見に共通するものが肝細胞内封入体であるMallory-Denk体 (MDB)形成である。これはユビキチン、p62やケラチン8と異常蛋白 (unfolded proteins)などからなる構造物であり、酸化ストレス、小胞体ストレス、遺伝子変異、ウイルス感染、プロテアソームの異常やオートファジーの異常がこの封入体の形成に関与していると考えられているが、その詳細な機序ならびに意義は未だ完全には明らかでない。いくつかの神経変性疾患や一部の筋疾患においても類似の細胞内封入体が形成される。Idiopathic copper toxicosis（特発性銅中毒症）は原因不明の銅代謝異常であるが、小児からこの構造物が生じる。我々はこの構造物が異常蛋白の蓄積、脂質負荷、C型肝炎ウイルス感染症や銅の負荷といった様々なストレスに対する細胞の反応であることを示してきたが、未だ正確な意義は明らかではない。本研究ではこの細胞内封入体の形成過程とこの構造物の意義を明らかとし、様々な肝疾患での各種の肝細胞のストレスへの対応とそれを利用した治療の可能性を考えたい。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

近年アルコール関連肝疾患や非アルコール性脂肪性肝疾患においてp62を介したNrf2の活性化やmTORの活性化が肝発癌に重要であることが明らかとなってきた。p62はオートファジーにより分解される基質であり、オートファジーの抑制にて細胞内に蓄積する。このようなp62の過剰な状態ではMallory-Denk体(MDB)が形成されることを我々は明らかにしてきた。今回、プロテアソーム阻害、脂肪負荷ならびに3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dihydrocollidine (DDC)を培養細胞とマウスに投与して酸化ストレス、小胞体ストレス、p62の発現ならびに局在、オートファジーの状態、MDB形成、Nrf2の核内移行ならびにNrf2の活性化によるHO1の発現とmTORのシグナルに関して検討を行なった。3種のストレスにより酸化ストレスと小胞体ストレスが引き起こされ、オートファジーの後期段階が障害された。またこれらの状態ではMDBが形成された。これらの状態ではNrf2の核内移行も認めたが、これはMDB形成細胞では抑制されていた。また、これらの状態ではmTORシグナルの亢進を認めた。微小菅重合阻害剤のあるノコダゾールやHDAC阻害剤であるトリコスタチンはMDBの形成を抑制し、Nrf2の核内移行を促進した。また、これらのMDB形成抑制はプロテアソーム阻害剤によるアポトーシスを促進した。またMDBの形成を抑制するとmTORのシグナルであるp-mTORやp-S6Kの発現が亢進していた。MDB形成によるp62や異常蛋白の隔離はNrf2の過剰活性化、mTORシグナルや異常蛋白による細胞死を抑制することが明らかとなった。オートファジーの活性化によるp62や異常蛋白の分解やMDB形成の調節はさまざまな肝疾患における細胞死や発癌を抑制出来る可能性があると考えられた。

今後の研究の推進方策

細胞の増殖調節にHippo-YAP (Yes-associated protein)シグナル伝達経路が重要であることが分かってきた。典型的には細胞の接触による細胞増殖の抑制はこの伝達経路の依存している。そのほかに細胞外基質の状態や細胞極性にも影響される。Hippoシグナル経路はYAPをリン酸化し、リン酸化されたYAPは細胞質に局在して14-3-3蛋白に結合するか、プロテアソームで分解される。Hippo経路がoffになるとYAPは活性化され、核へ移行してTEADを介して細胞増殖、抗アポトーシスや epithelial-mesenchymal transitionに関与するような蛋白の翻訳を亢進させる。小胞体ストレスの程度によってPERK、eIF1a。ATF4を介してYAPを活性化して細胞を生存させ、また、異なる程度によってはHippo、GADD34を介して細胞死を引き起こす。そのため様々な小胞体ストレス誘導剤にてストレスの程度を変えて細胞への影響を検討する。またYAP阻害剤であるverteporfinやオートファジーの調節の影響を調べる。
Mallory-Denk体が様々なストレスに対する細胞の反応であることを示してきたが、それ以外の反応として近年ストレス顆粒という構造物が注目されている。より軽いストレスで一過性に出現する蛋白の翻訳を抑制する構造物と考えられるが、様々なストレスならびにオートファジーの調節がストレス顆粒形成に如何に影響するかをG3BP陽性顆粒の形成で確認してこの顆粒形成の細胞増殖ならびに細胞死での意義を調べる。

次年度使用額が生じた理由

古い試薬等を使い、研究費をなるべく節約しています。
Hippo-YAP経路とストレス顆粒の検討の解析のための抗体ならびに試薬は高価なものが多く、かなりの出費を予想しています。

研究成果

• [雑誌論文] アルコールと肝疾患 (2022)
  • 著者名/発表者名: 原田 大
  • 雑誌名: 日本消化器病学会雑誌 巻: 119 ページ: 9-
  • 査読あり
• [雑誌論文] Trends in hepatocellular carcinoma incident cases in Japan between 1996 and 2019 (2022)
  • 著者名/発表者名: Nakano M, Yatsuhashi H, Bekki S, Takami Y, Tanaka Y, Yoshimaru Y, Honda K, Komorizono Y, Harada M, Shibata M, Sakisaka S, Shakado S, Nagata K, Yoshizumi T, Itoh S, Sohda T, Oeda S, Nakao K, Sasaki R, Yamashita T, Ido A, Mawatari S, Nakamuta M, Aratake Y, Matsumoto S, Maeshiro T, Goto T, Torimura T
  • 雑誌名: Sci Rep 巻: 12 ページ: 1517
  • DOI: 10.1038/s41598-022-05444-z.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] ヘモクロマトーシス (2022)
  • 著者名/発表者名: 原田 大、本間雄一、熊元啓一郎
  • 雑誌名: 肝胆膵 巻: 84 ページ: 443-446
• [雑誌論文] Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition)1 (2021)
  • 著者名/発表者名: Klionsky DJ, Abdel-Aziz AK, Harada M et al.
  • 雑誌名: Autophagy 巻: 17 ページ: 1-382
  • DOI: 10.1080/15548627.2020.1797280.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Trehalose alleviates oxidative stress-mediated liver injury and Mallor-Denk body formation via activating autophagy in mice (2021)
  • 著者名/発表者名: Honma Y, Sato-Morita M, Katsuki Y, Mihara H, Baba R, Hino K, Kawashima A, Ariyasu T, Harada M.
  • 雑誌名: Med Mol Morphol 巻: 54 ページ: 41-51
  • DOI: 10.1007/s00795-020-00258-2
  • 査読あり
• [雑誌論文] Diagnosis for Wilson disease: this disease may not be a rare disease (2021)
  • 著者名/発表者名: Harada M
  • 雑誌名: J Gastroenterol 巻: 56 ページ: 114-115
  • DOI: 10.1007/s00535-020-01752-1
  • 査読あり
• [雑誌論文] Airborne fine particulate matter in Japan induces lipid synthesis and inhibits autophagy in HepG2 cells. (2021)
  • 著者名/発表者名: Ogino N, Miyagawa K, Nagaoka K, Sumida K, Kusanaga M, Oe S, Honma Y, Shibata M, Harada M, Suganuma N, Ogino K
  • 雑誌名: Int J Biochem Cell Biol 巻: 141 ページ: 106099
  • DOI: 10.1016/j.biocel.2021.106099.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Role of HO-1 against saturated fatty acid-induced oxidative stress in hepatocytes (2021)
  • 著者名/発表者名: Ogino N, Miyagawa K, Nagaoka K, Matsuura-Harada Y, Ogino S, Kusanaga M, Oe S, Honma Y, Harada M, Eitoku M, Suganuma N, Ogino K
  • 雑誌名: Nutrients 巻: 13 ページ: 993
  • DOI: 10.3390/nu13030993.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Correlation of hepatitis C virus-mediated endoplasmic reticulum stress with autophagic flux impairment and hepatocarcinogenesis (2021)
  • 著者名/発表者名: Honma Y, Miyagawa K, Hara Y, Hayashi T, Kusanaga M, Ogino N, Minami S, Oe S, Ikeda M, Hino K, Harada M
  • 雑誌名: Med Mol Morphol 巻: 54 ページ: 108-121
  • DOI: 10.1007/s00795-020-00271-5.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Type 4B hereditary hemochromatosis due to heterozygous p.D157A mutation in SLC40A1 complicated with hypopituitarism (2021)
  • 著者名/発表者名: Honma Y, Karasuyama T, Kumamoto K, Shimajiri S, Toki Y, Tatsumi Y, Sumida K, Koikawa K, Morino K, Oe S, Miyagawa K, Yamasaki M, Shibata M, Abe S, Ikuta K, Hayashi H, Harada M
  • 雑誌名: Med Mol Morphol 巻: 54 ページ: 60-67
  • DOI: 10.1007/s00795-020-00259-1
• [雑誌論文] Possible contribution of hepatocyte secretion to the elevation of plasma exosomal arginase-1 in high-fat diet-fed mice (2021)
  • 著者名/発表者名: Ogino N, Takahashi H, Nagaoka K, Harada Y, Kubo M, Miyagawa K, Kusanaga M, Oe S, Honma Y, Harada M, Eitoku M, Suganuma N, Ogino K
  • 雑誌名: Life Sci 巻: 278 ページ: 119588
  • DOI: 10.1016/j.lfs.2021.119588.
  • 査読あり
• [雑誌論文] ウィルソン病 小児期からの発症病 と長期的肝胆道合併症 (2021)
  • 著者名/発表者名: 原田 大、大江 晋司、草永 真志、本間 雄一
  • 雑誌名: 肝胆膵 巻: 82 ページ: 413-416
• [雑誌論文] 肝障害で見逃してはならない疾患 Wilson病、α1-アンチトリプシン欠損、 原発性胆汁性胆管炎、自己免疫性肝炎 (2021)
  • 著者名/発表者名: 原田 大
  • 雑誌名: Medicina 巻: 58 ページ: 432-434
• [雑誌論文] ウイルソン病 (2021)
  • 著者名/発表者名: 原田 大、草永真志、大江晋司、本間雄一
  • 雑誌名: 消化器・肝臓内科 巻: 9 ページ: 531-534
• [学会発表] 肝細胞の各種ストレスへの対応 (2022)
  • 著者名/発表者名: 原田 大
  • 学会等名: 第17回酸化ストレスと肝研究会
  • 招待講演
• [学会発表] Keep1-Nrf2システムに対するMallory-Denk体の役割 (2022)
  • 著者名/発表者名: 大江 晋司、林 倫留、草永 真志、荻野 学芳、宮川 恒一郎、本間 雄一、原田 大
  • 学会等名: 第17回酸化ストレスと肝研究会
• [学会発表] アルコール性肝障害に関する研究の進歩 (2021)
  • 著者名/発表者名: 原田 大
  • 学会等名: 第107回日本消化器病学会総会
  • 招待講演
• [学会発表] 遺伝性ヘモクロマトーシスとウイルソン病の課題 (2021)
  • 著者名/発表者名: 本間 雄一、大江 晋司、原田 大
  • 学会等名: 第57回日本肝臓学会総会
• [学会発表] 移行期におけるウイルソン病患者の問題点 (2021)
  • 著者名/発表者名: 大江 晋司、本間 雄一、原田 大
  • 学会等名: 第57回日本肝臓学会総会
• [学会発表] Mallory-Denk体による肝細胞保護作用 (2021)
  • 著者名/発表者名: 林 倫留、大江 晋司、原田 大
  • 学会等名: 57回日本肝臓学会総会
• [学会発表] DAA治療SVR後の新規肝発癌における肥満と糖代謝の意義 (2021)
  • 著者名/発表者名: 本間 雄一、柴田 道彦、原田 大
  • 学会等名: 第25回日本肝臓学会大会
• [学会発表] PM2.5は肝細胞の脂肪滴形成を誘導し、小胞体ストレスとオートファジーの後期段階の障害を惹起する (2021)
  • 著者名/発表者名: 荻野 学芳、宮川 恒一郎、草永 真志、大江 晋司、本間 雄一、柴田 道彦、荻野 景規、菅沼 成文、原田 大
  • 学会等名: 第53回日本臨床分子形態学会総会・学術集会
• [図書] 内科学 (2022)
  • 著者名/発表者名: 原田 大
  • 総ページ数: 2
  • 出版者: 朝倉書店
• [図書] 別冊日本臨床 肝・胆道系症候群（第3版）‐その他の肝・胆道系疾患を含めて- 肝臓編（下） (2021)
  • 著者名/発表者名: 原田 大、大江 晋司、草永 真志
  • 総ページ数: 4
  • 出版者: 日本臨床社
• [図書] 今日の治療薬 (2021)
  • 著者名/発表者名: 原田 大
  • 総ページ数: 1
  • 出版者: 医学書院
• [図書] 消化器疾患最新の治療2021-2022 (2021)
  • 著者名/発表者名: 原田 大
  • 総ページ数: 2
  • 出版者: 南江堂