| 研究課題/領域番号 |
21K07934
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| 研究機関 | 千葉大学 |
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研究代表者 |
関 元昭 千葉大学, 医学部附属病院, 特任助教 (70714278)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | EBウイルス胃癌 / DNAバーコード |
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| 研究実績の概要 |
胃癌のサブグループであるEpstein-Barrウイルス陽性胃癌（EBV胃癌）は、EBウイルスへの感染と、それに続くDNAメチル化によって癌抑制遺伝子が不活性化され発癌に至る。しかし、上皮細胞へのウイルス感染から発癌至るエピゲノム制御は明らかではない。本研究ではEBV胃癌発癌の分子メカニズムを明らかにすることを目的としている。
今年度は、EBウイルス感染時の宿主細胞の不均一性について解析を行った。まず、前年度までに樹立していたDNAバーコード発現型GES1細胞を用いて、EBウイルス感染実験を行った。EBウイルス感染後の細胞からDNAバーコード配列を増幅し、シークエンシングした結果、初期細胞集団に含まれる約850種類のバーコードのうち、5種類のバーコードが再現良く濃縮していた。一方、レンチウイルスを用いた対照実験において濃縮していたバーコード配列は、非感染細胞で濃縮していたバーコード配列が多く含まれていた。以上より、レンチウイルスが確率論的に細胞に感染するのに対し、EBウイルスが細胞に感染し、細胞内で維持される上ではクローン間の不均一性があると考えられ、EBウイルス感染における「エリート細胞」の存在が示唆された。今後、EBウイルス感染前後の細胞集団を用いた、シングルセルRNAseq解析を行う。本研究で用いるDNAバーコードはmRNAに転写されるため、任意の細胞の遺伝子発現プロファイルがどのクローンに由来するかを明らかにすることができる。従って、「エリート細胞」における遺伝子発現プロファイル、あるいはクローンごとのEBウイルス感染に伴う遺伝子発現変動が明らかにできると考えられる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
令和3年度の進捗を踏まえ、令和4年度以降は細胞老化にこだわらずにEBウイルス感染と発癌のメカニズム解析を行っている。今年度は樹立したDNAバーコード導入細胞を使ってEBウイルス感染実験を行い、感染4週間後に細胞を回収した。細胞から抽出したゲノムDNAから、DNAバーコード領域を増幅し、超並列シークエンサーにて配列を解析した。その結果、感染後に特定のDNAバーコードが濃縮されていることを観察した。この結果から、用いた細胞集団には不均一性があり、一部のクローンがEBウイルス感染あるいは維持に優位であることが示唆された。
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| 今後の研究の推進方策 |
EBウイルス感染における「エリート細胞」の特徴を明らかにするために、今年度にDNAバーコード配列の解析を行った細胞群のシングルセル遺伝子発現解析を行う。まず、感染前の細胞集団を用いてChromiumによってRNAseq用ライブラリを調整する。この際、本研究で導入したDNAバーコードも転写されていることから、RNAseqライブラリを鋳型にしたPCRによって、DNAバーコード配列由来のライブラリを選択的に調整する。一般的なシングルセルRNAseq解析で細胞ごとの遺伝子発現プロファイルを取得したのち、各細胞のプロファイルにDNAバーコード配列を紐付けることで、クローンごとの遺伝子発現プロファイルを一斉に解析する。さらに今年度同定した「エリート細胞」由来のバーコードを持つ5種類のクローンについて、特徴的な遺伝子発現を明らかにし、EBウイルスの感染や維持に寄与する分子機構について考察する。
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