研究課題
肝発がん当初から線維化を形成する活性化した肝星細胞(Hepatic stellate cell, HSC)と肝細胞間には相互作用があり肝細胞のがん化や成長に関係する事が推測されるがその直接的証拠はない。私が所属した研究室(大阪市立大学、肝胆膵病態内科)において、肝ではHSCsのみに発現するグロビン蛋白質の一つであるCytoglobin(CYGB)が発見され、 グロビンに共通の蛋白機能が解明された。同時に、Cygb欠損マウスを用いた数種のin vivo肝障害モデルによりHSCsにおけるCYGB欠損が肝炎症・線維化反応を増強させ、延いては肝発がんを促進することが証明された。CYGBはHSCs活性化の鍵因子であり、その欠損は活性酸素や生理活性因子、細胞外マトリックスの過剰産生を惹起した。これまでの成果を基にHSCsにおけるCYGBの発現調節機構を詳細に解析すると同時に、本研究では、HSC活性化が持続的かつ不可逆的になるHSC活性化スイッチ機構が存在し、それが肝硬変の難治性に繋がっていると考え、CYGB-HSC軸が隣接する肝細胞のDNA損傷を通じた発がんにどのように寄与するかについて解明する研究に着手した。HSCsのCYGB発現がヒドロキシ(・OH)ラジカル消去に関わり、その欠損がDNA酸化障害を助長したことを見出した。さらに、ヒトアルコール脂肪性肝炎において、HSCのCYGBの発現減少がDNA損傷と負の相関を示すことを明らかにした。この結果を基に、マウスHSCのCygbが欠損したノックアウト(KO)の肝臓からミトコンドリアを採取・精製し、ミトコンドリアの呼吸鎖に関連する酵素活性の測定を行い肝細胞とHSCの相互作用をさらに解明すべく研究を継続している。
2: おおむね順調に進展している
当初の目的通り(a)DNA損傷関連因子であるPARP1に着目し、TGF-β処理後H2O2に暴露されたHSC細胞(CYGB低発現)のDNAを採取し、ChIP- Sequecing用のDNAのSonicationおよびLibrary作製を行った。さらに、(b)Cygb欠損マウスの肝臓よりミトコンドリアを採取・精製し、ミトコンドリアの呼吸鎖に関連する酵素活性を測定した。さらに、(c)肝細胞とHSCの共培養実験を行い、HSC-Cygb欠損による肝細胞への影響を調べた(b)に関しては当初の計画以上の進展している。
今年度、1)CYGB発現を調整したHSCsとHepG2細胞との共培養:共培養により肝細胞側の酸化ストレスマーカー4-HNE、8-OHdG発現による酸化的DNA損傷の有無、γH2AX発現 によるDNA double-strand break の有無を検討する。この場合、TGF-βをはじめとする発がん関連因子(成長因子、サイトカイン、ケモカイン等)やH2O2の存在で反応が加速されるか検討する。 (2) CYGBが低発現した場合に肝細胞DNA障害が生じると推測している。その機序について、 TGF-β処理後H2O2に暴露されたHSC細胞(CYGB低発現)のDNAに対し、PARP1抗体を用いたChIP-Sequencingの解析を継続し、PARP1標的部位の同定を行う。(3)Cygb KOマウスの肝臓から採取したミトコンドリア呼吸鎖の酵素活性を調べた研究をまとめ報告する。
今年度、概ね順調に研究が進んだ。そのため、論文投稿準備の予算分を次年度に残すことにした。
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すべて 雑誌論文 (4件) (うち国際共著 4件、 査読あり 4件、 オープンアクセス 4件) 学会発表 (6件) (うち国際学会 3件) 備考 (1件)
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