C型肝炎ウイルスおよび新型コロナウイルス複製に必要な膜小胞の形成メカニズムの解析

2021 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 21K07974
• 研究機関: 国立感染症研究所
• 研究代表者: 相崎 英樹 国立感染症研究所, ウイルス第二部, 室長 (00333360)
• 研究期間 (年度): 2021-04-01 – 2024-03-31
• キーワード: C型肝炎ウイルス / 新型コロナウイルス / doble membrane vesicle / NS5A / サブゲノミックレプリコン

研究実績の概要

本研究の目的は、C型肝炎ウイルス(HCV)をモデルとしてdoble membrane vesicles (DMV)形成に関与する宿主因子を見い出し、DMV形成のメカニズムを明らかにすることである。本研究ではNS5A膜 結合タンパクを見出し、そのHCV複製・DMV形成に関与する役割を解明することを目的とする。見出されたタンパクが新型コロナウイルスの増殖 に影響を与えるかを新型コロナウイルス細胞培養系で調べる。さらに、NS5AがDMV形成に必須なことが知られている。そこで、Huh7細胞にサブゲノミックレプリコンを導入し、NS5Aで免疫沈降反応を行なって、プロテオーム解析を行なったところ、NS5A結合タンパクとして11β-Hydroxysteroid dehydrogenase (HSD11)を見出した。さらに、脂肪滴周辺膜の比較プロテオーム解析からもHSD11を見出した。興味深いことに、HSD11のノックダウンは短期的にはHCVRNAの複製には影響を与えなかったものの、ウイルス粒子産生を抑制した。HSD11は肝臓と脂肪組織の糖質コルチコイド濃度を調整する生理作用がある。wild-type HSD11の強制発現によりHCV粒子産生の増加がみられたが、脂肪滴局在シグナル欠損HSD11ではHCV粒子産生が減少したことから、HSD11の脂肪滴局在性がHCV粒子産生に重要な役割を果たしてい可能性が示唆された。
最近、トランスポゾンの逆転写酵素活性により、新型コロナウイルス(SARS-CoV-2)遺伝子の一部が逆転写され、宿主細胞遺伝子に組み込まれる可能性が報告された。本研究はSARS-CoV-2感染細胞を解析し、SARS-CoV-2感染細胞からRNAおよびDNAを抽出し、細胞内におけるSARS-CoV-2の存在様式について次世代シークエンサーを用いて遺伝子発現解析を行なった。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

HCVのゲノムRNAが自己複製するレプリコンを持つ細胞株から、NS5A結合膜タンパクを網羅的に同定した。同定した宿主因子について、siRNAを合成し、感染細胞へ導入する。目的タンパク質の十分な発現低下を確認した後、細胞内、培養上清中のHCV-RNA量への影響をリアルタイムRT-PCR法で解析した。強くHCV粒子産生を抑制する因子として、HSD11を見出した。HSD11は肝臓と脂肪組織の糖質コルチコイド濃度を調整する生理作用がある。wild-type HSD11の強制発現によりHCV粒子産生の増加がみられたが、脂肪滴局在シグナル欠損HSD11ではHCV粒子産生が減少したことから、HSD11の脂肪滴局在性がHCV粒子産生に重要な役割を果たしてい可能性が示唆された。オレイン酸で脂肪滴合成を亢進させたHuh7細胞に、HSD11 siRNAまたは脂肪滴局在シグナル欠損HSD11導入したところ、 細胞内のLDの数、大きさが減少した。一方、野生型HSD11を発現させたところ、脂肪滴分画中のLDの数、大きさが増加した。オレイン酸で脂肪滴合成を亢進させたHuh7細胞に脂肪滴局在シグナル欠損HSD11導入し、HSD11の発現とADRPの共局在を観察したところ、 発現部位、細胞ではADRPが観察できなかった。

今後の研究の推進方策

HSD11には酵素としての作用、脂肪滴周辺膜への結合タンパクの輸送作用が考えられた。さらにHSD13は肝臓の線維化に関与していることが報告されている。HSD11またはHSD13欠損細胞を作成し、そこに酵素活性欠損、脂肪的移行欠損等の各種delation mutantを発現させることにより、それぞれの機能がHCVの生活環にどのように関わっているか検討する。
さらに、SARS-CoV-2感染患者組織からRNAおよびDNAを抽出し、細胞内におけるSARS-CoV-2の存在様式について次世代シークエンサーを用いて遺伝子発現解析を行なう。

次年度使用額が生じた理由

SARS-CoV-2完治後、手術を受けた患者サンプルの入手が難しく時間がかかったため、当該助成金が発生した。翌年度分として、SARS-CoV-2感染患者組織からRNAおよびDNAを抽出し、細胞内におけるSARS-CoV-2の存在様式について次世代シークエンサーを用いて遺伝子発現解析を行なう。

研究成果

• [雑誌論文] Interferon-gamma induced APOBEC3B contributes to Merkel cell polyomavirus genome mutagenesis in Merkel cell carcinoma. (2021)
  • 著者名/発表者名: Que L, Li Y, Dainichi T, Kukimoto I, Nishiyama T, Nakano Y, Shima K, Suzuki T, Sato Y, Horike S, Aizaki H, Watashi K, Kato T, Aly HH, Watanabe N, Kabashima K, Wakae K, Muramatsu M.
  • 雑誌名: J Invest Dermatol. 巻: S0022-202X ページ: 02636-1
  • DOI: 10.1016/j.jid.2021.12.019.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Development of an intervention system for linkage-to-care and follow-up for hepatitis B and C virus carriers. (2021)
  • 著者名/発表者名: Kikuchi M, Sawabe M, Aoyagi H, Wakae K, Watashi K, Hattori S, Kawabe N, Yoshioka K, Tanaka J, Muramatsu M, Wakita T, Aizaki H
  • 雑誌名: Hepatol Int. 巻: 16 ページ: 68-80
  • DOI: 10.1007/s12072-021-10269-5.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Prolonged Gut Dysbiosis and Fecal Excretion of Hepatitis A Virus in Patients Infected with Human Immunodeficiency Virus. (2021)
  • 著者名/発表者名: Ishizaka A, Koga M, Mizutani T, Lim LA, Adachi E, Ikeuchi K, Ueda R, Aoyagi H, Tanaka S, Kiyono H, Matano T, Aizaki H, Yoshio S, Mita E, Muramatsu M, Kanto T, Tsutsumi T, Yotsuyanagi H
  • 雑誌名: Viruses. 巻: 13 ページ: 2101
  • DOI: 10.3390/v13102101.
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] NTCP oligomerization occurs downstream of the NTCP-EGFR interaction during hepatitis B virus internalization. (2021)
  • 著者名/発表者名: Fukano K, Oshima M, Tsukuda S, Aizaki H, Ohki M, Park SY, Wakita T, Wakae K, Watashi K, Muramatsu M
  • 雑誌名: J Virol. 巻: 95 ページ: e0093821
  • DOI: 10.1128/JVI.00938-21
  • 査読あり
• [雑誌論文] Cellular OCIAD2 protein is a proviral factor for hepatitis C virus replication. (2021)
  • 著者名/発表者名: Yang Z, Ouyang T, Aoyagi H, Wang T, Xing X, Zhang Y, Wang Y, Li Y, Aizaki H, Li S, Kong L
  • 雑誌名: Int J Biol Macromol. 巻: 188 ページ: 147-159
  • DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2021.08.032.
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Identification of natural compounds extracted from crude drugs as novel inhibitors of hepatitis C virus. (2021)
  • 著者名/発表者名: Zheng X, Guo R, Liu Q, Wakae K, Watanabe N, Fukano K, Que L, Li Y, Aly HH, Watashi K, Suzuki R, Murayama A, Kato T, Aizaki H, Wakita T, Huang X, Yan Y, Song SJ, Muramatsu M
  • 雑誌名: Biochem Biophys Res Commun. 巻: 567 ページ: 1-8
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2021.06.022.
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Oncogenic transcriptomic profile is sustained in the liver after the eradication of the hepatitis C virus. (2021)
  • 著者名/発表者名: Takeda H, Takai A, Iguchi E, Mishima M, Arasawa S, Kumagai K, Eso Y, Shimizu T, Takahashi K, Ueda Y, Taura K, Hatano E, Iijima H, Aoyagi H, Aizaki H, Marusawa H, Wakita T, Seno H.
  • 雑誌名: Carcinogenesis. 巻: 42 ページ: 672-684
  • DOI: 10.1093/carcin/bgab014
  • 査読あり
• [学会発表] Development of a community-based intervention system for linkage to care and follow-up for hepatitis virus-positive individuals cooperating with health care providers (2021)
  • 著者名/発表者名: Minami Kikuchi, Haruyo Aoyagi, Kosho Wakae, Koichi Watashi, Satoru Hattori, Naoto Kawabe, Kentaro Yoshioka, Junko Tanaka, Masamichi Muramatsu, Takaji Wakita, Motoji Sawabe, Hideki Aizaki
  • 学会等名: Global Heapatitis Summit, The 17th International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease
  • 国際学会
• [学会発表] Abnormal hepatocellular organelles in patients with sustained virological response (2021)
  • 著者名/発表者名: Haruyo Aoyagi, Hiroko Iijima Minami Kikuchi, Mami Matsuda, Koichi Watashi, Ryosuke Suzuki, Takahiro Masaki, Noritomo Shimada, Keizo Kato, Akihito Tsubota, Takeya Tsutsumi, Kazuya Okushin, Kyoji Moriya, Kazuhiko Koike, Masamichi Muramatsu, Kenjiro Wake, Takaji Wakita, Hideki Aizaki
  • 学会等名: The 21th International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses
  • 国際学会
• [学会発表] NTCP oligomerization is initiated downstream of the NTCP-EGFR interaction during HBV internalization (2021)
  • 著者名/発表者名: Kento Fukano, Mizuki Oshima, Senko Tsukuda, Hideki Aizaki, Mio Ohki, Sam-Yong Park, Takaji Wakita, Kousho Wakae, Koichi Watashi, Masamichi Muramatsu
  • 学会等名: International HBV meeting
  • 国際学会
• [学会発表] SLC10A1/NTCP多量体形成が制御するB型肝炎ウイルス細胞内侵入機構の解析 (2021)
  • 著者名/発表者名: 深野顕人, 大嶋美月, 九十田千子, 相崎英樹, 大木規央, 朴三用, 脇田隆字, 若江亨祥, 渡士幸一, 村松正道
  • 学会等名: 第94回日本生化学大会
• [学会発表] 新規の作用によりB型肝炎ウイルス感染を阻害する酸化ステロール合成誘導体の同定 (2021)
  • 著者名/発表者名: 大嶋美月, 深野顕人, 岩本将士, Frank Stappenbeck, Feng Wang, 鄭シン, 山崎雅子, 若江亨祥, 相崎英樹, 倉持幸司, 村松正道, 脇田隆字, Farhad Parhami, 渡士幸一
  • 学会等名: 日本薬学会第141年会
• [学会発表] 感染受容体NTCPの多量体化が導くB型肝炎ウイルス内在化機構の解明 (2021)
  • 著者名/発表者名: 深野顕人, 大嶋美月, 九十田千子, 相崎英樹, 大木規央, 朴三用, 脇田隆字, 若江亨祥, 渡士幸一, 村松正道
  • 学会等名: 日本薬学会第141年会
• [学会発表] 自治体と医療関係者が連携した肝炎ウイルスキャリアの動向調査および陽性者のフォローアップシステムによる行動変容の解析 (2021)
  • 著者名/発表者名: 菊池みなみ, 川部直人, 青柳東代, 服部悟, 若江亨祥, 渡士幸一, 吉岡健太郎, 佐竹正博, 是永匡昭, 田中純子, 村松正道, 脇田隆字, 沢辺元司, 相崎英樹
  • 学会等名: 第57回日本肝臓学会総会
• [学会発表] Identification of an oxysterol derivative that inhibits HBV infection by interrupting NTCP oligomerization (2021)
  • 著者名/発表者名: Oshima M, Fukano K, Iwamoto M, Stappenbeck F, Wang F, Wakae K, Aizaki H, Kuramochi K, Muramatsu M, Wakita T, Parhami F, Watashi K
  • 学会等名: 第68回日本ウイルス学会
• [学会発表] HIV陽性者におけるA型肝炎ウイルス罹患による急性炎症と腸内細菌叢の動態解析 (2021)
  • 著者名/発表者名: 石坂 彩、古賀 道子、水谷 壮利、林 阿英、安達 英輔、池内 和彦、上田 竜大、青柳 東代、清野 宏、俣野 哲朗、相崎 英樹、由雄 祥代、村松 正道、考藤 達哉、堤 武也、四柳 宏
  • 学会等名: 第35回日本エイズ学会学術集会
• [図書] Ｃ型肝炎ウイルスの感染増殖と病原性発現メカニズム、創薬研究者がこれだけは知っておきたい最新のウイルス学 (2021)
  • 著者名/発表者名: 相崎英樹
  • 総ページ数: 9
  • 出版者: 技術情報協会
• [図書] C型肝炎のウイルス学と病態、C型肝疾患の今後の課題―肝炎、肝硬変、肝がん― (2021)
  • 著者名/発表者名: 青柳東代、村松正道、脇田隆字、相崎英樹
  • 総ページ数: 8
  • 出版者: 消化器内科
• [備考] 相崎英樹、石井孝司、A型肝炎、お医者さんオンライン、プレシジョン、
  • URL: https://www.premedi.co.jp/%E3%81%8A%E5%8C%BB%E8%80%85%E3%81%95%E3%82%93%E3%82%AA%E3%83%B3%E3%83%A9%E3%82%A4%E3%83%B3/h00448