C型肝炎ウイルスおよび新型コロナウイルス複製に必要な膜小胞の形成メカニズムの解析

2022 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 21K07974
• 研究機関: 国立感染症研究所
• 研究代表者: 相崎 英樹 国立感染症研究所, ウイルス第二部, 室長 (00333360)
• 研究期間 (年度): 2021-04-01 – 2024-03-31
• キーワード: C型肝炎ウイルス / 新型コロナウイル / doble membrane vesicle / NS5A / サブゲノミックレプリコン / HSD11

研究実績の概要

本研究の目的は、C型肝炎ウイルス(HCV)をモデルとしてdoble membrane vesicles (DMV)形成に関与する宿主因子を見出し、DMV形成のメカニズムを明らかにすることである。HCVのDMV形成についてはNS5AがDMV形成に必須なことが知られている。そこで、Huh7細胞にサブゲノミックレプリコンを導入し、NS5Aで免疫沈降反応を行なって、プロテオーム解析を行なったところ、NS5A結合タンパクとして11β-Hydroxysteroid dehydrogenase (HSD11)を見出した。さらに、脂肪滴周辺膜の比較プロテオーム解析からもHSD11を見出し、HSD11がウイルス粒子産生に重要な役割を持つことを示した。HSD11は多くの臓器に広く分布している。一方、HSD13はHSD11と近い構造を持ち、機能も類似しているが、肝細胞に主に存在している。そこで、HSD13とHCV粒子形成の関連性を調べている。
SARS-CoV-2に感染したVero細胞及び腸管オルガノイドからRNAおよびDNAを抽出し、qRT-PCR、qPCRを行った結果、RNAとDNAの両方からウイルス遺伝子の増幅が観察された。また、COVID-19罹患後の大腸検体を用いた解析でも、RNAとDNAの両方からランダムに増幅されていることが明らかになり、SARS-CoV-2が逆転写される可能性が示唆されている。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

これまでの研究から、HSD11の脂肪滴局在性がHCV粒子産生に重要な役割を果たす可能性が示唆された。HSD11は多くの臓器に広く分布している。一方、HSD13はHSD11と近い構造を持ち、機能も類似しているが、肝細胞に主に存在している。そこで、HSD13とHCV粒子形成の関連性を調べるため、HSD13欠損細胞株を作製した。さらに、HSD13の脂肪滴局在シグナル欠損、酵素活性欠損など14種類のプラスミドを作成した。その後、レンチウイルスを用いて、野生型HSD13を含めて、HSD13欠損株に戻した細胞株を作成し、GFPの発現により、レンチウイルスでのHSD13及びそれら変異体の導入を確認した。
SARS-CoV-2を感染させたVero細胞及びから腸管オルガノイドからRNAおよびDNAを抽出し、それぞれqRT-PCR、qPCRを行なったところ、RNAからだけでなくDNAからもN遺伝子の増幅が観察された。さらに、感染Vero細胞からRNA、DNAを抽出し、SARS-CoV-2の全長を網羅的に増幅させる９８種類のプライマーを用いて増幅し、イルミナシークエンサーでシークエンスを行なった。得られたリードをヒトゲノムにマッピングし、マップされなかったリードをSARS-CoV-2にマッピングするという手法で解析したところ、RNAではほぼゲノム全長にわたって増幅されており、一方でDNAでもランダムに増幅箇所があることが明らかになった。COVID-19罹患後の大腸検体を用いて同様の解析を行ったところ、増幅箇所に規則性や共通性はないが、RNA、DNAともにランダムに増幅されていることが示された。これらのことはSARS-CoV-2が逆転写されている可能性が示唆される。

今後の研究の推進方策

HCV粒子形成におけるHSD11の役割として、酵素としての活性、脂肪滴周辺膜への結合タンパクの輸送作用が想定された。さらに、興味深いことに、HSD13は肝臓の線維化に関与していることが報告されている。HSD11またはHSD13欠損細胞を作成し、そこに酵素活性欠損、脂肪滴局在シグナル欠損等の各種HSD11, 13の欠損体を発現させることにより、それぞれの機能がHCVの生活環にどのように関わっているか検討する。
さらに、SARS-CoV-2感染患者組織からRNAおよびDNAを抽出し、細胞内におけるSARS-CoV-2の存在様式について次世代シークエンサーを用いて遺伝子発現解析を行なう。今後は逆転写される機序をホストのレトロトランスポゾンに注目して解析する予定である。

次年度使用額が生じた理由

当初、HSD11がウイルス粒子産生に重要な役割を持つことを示した。HSD11は多くの臓器に広く分布している。一方、HSD13はHSD11と近い構造を持ち、機能も類似しているが、肝細胞に主に存在しているため、肝臓での病態に関与している可能性が考えられる。そこで、HSD13とHCV粒子形成の関連性についても解析を新たに始めたため、次年度使用額が生じた。

研究成果

• [雑誌論文] Patient-derived monoclonal antibody neutralizes HCV infection in vitro and vivo without generating escape mutants (2022)
  • 著者名/発表者名: Yokokawa Hiroshi、Shinohara Midori、Teraoka Yuji、Imamura Michio、Nakamura Noriko、Watanabe Noriyuki、Date Tomoko、Aizaki Hideki、Iwamura Tomokatsu、Narumi Hideki、Chayama Kazuaki、Wakita Takaji
  • 雑誌名: PLOS ONE 巻: 17 ページ: -
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0274283
  • 査読あり
• [雑誌論文] Independent evolution of multi-dominant viral genome species observed in a hepatitis C virus carrier (2022)
  • 著者名/発表者名: Ando Tomomi、Aizaki Hideki、Sugiyama Masaya、Date Tomoko、Hayashi Kazuhiko、Ishigami Masatoshi、Katano Yoshiaki、Goto Hidemi、Mizokami Masashi、Muramatsu Masamichi、Kuroda Makoto、Wakita Takaji
  • 雑誌名: Biochemistry and Biophysics Reports 巻: 32 ページ: 101327～101327
  • DOI: 10.1016/j.bbrep.2022.101327
  • 査読あり
• [雑誌論文] Development and Use of a Kinetical and Real-Time Monitoring System to Analyze the Replication of Hepatitis C Virus (2022)
  • 著者名/発表者名: Li Xiaoyu、Ito Masahiko、Aoyagi Haruyo、Murayama Asako、Aizaki Hideki、Fukasawa Masayoshi、Kato Takanobu、Wakita Takaji、Suzuki Tetsuro
  • 雑誌名: International Journal of Molecular Sciences 巻: 23 ページ: 8711～8711
  • DOI: 10.3390/ijms23158711
  • 査読あり
• [雑誌論文] Induction of neutralizing antibodies against hepatitis C virus by a subviral particle-based DNA vaccine (2022)
  • 著者名/発表者名: Yato Keigo、Matsuda Mami、Watanabe Noriyuki、Watashi Koichi、Aizaki Hideki、Kato Takanobu、Tamura Koji、Wakita Takaji、Muramatsu Masamichi、Suzuki Ryosuke
  • 雑誌名: Antiviral Research 巻: 199 ページ: 105266～105266
  • DOI: 10.1016/j.antiviral.2022.105266
  • 査読あり
• [雑誌論文] Development of an intervention system for linkage-to-care and follow-up for hepatitis B and C virus carriers (2022)
  • 著者名/発表者名: Kikuchi Minami、Sawabe Motoji、Aoyagi Haruyo、Wakae Kosho、Watashi Koichi、Hattori Satoru、Kawabe Naoto、Yoshioka Kentaro、Tanaka Junko、Muramatsu Masamichi、Wakita Takaji、Aizaki Hideki
  • 雑誌名: Hepatology International 巻: 16 ページ: 68～80
  • DOI: 10.1007/s12072-021-10269-5
  • 査読あり
• [学会発表] Hepatocellular organellar abnormalities following elimination of hepatitis C virus (2022)
  • 著者名/発表者名: Haruyo Aoyagi, Hiroko Iijima, Minami Kikuchi, Mami Matsuda, Koichi Watashi, Ryosuke Suzuki, Takahiro Masaki, Noritomo Shimada, Keizo Kato, Akihito Tsubota, Ayako Mimata, Yuriko Sakamaki, Shizuko Ichinose, Masamichi Muramatsu, Kenjiro Wake, Masaya Sugiyama, Masashi Mizokami, Takaji Wakita, Hideki Aizaki.
  • 学会等名: 28th International Symposium on Hepatitis C Virus, Flaviviruses, and Related Viruses
  • 国際学会
• [学会発表] C型肝炎ウイルス除去後のオルガネラ異常 (2022)
  • 著者名/発表者名: 青柳東代、飯島尋子、松田麻未、若江亨祥、渡士幸一、鈴木亮介、政木隆博、杉山真也、坪田昭人、島田紀朋、加藤慶三、林和彦、榎本大、三又絢子、酒巻有里子、市野瀬志津子、村松正道、溝上雅史、和氣健二郎、脇田隆字、相崎英樹
  • 学会等名: 第６９回日本ウイルス学会学術集会
• [学会発表] RHV RNA複製の高いcured細胞の樹立とその評価 (2022)
  • 著者名/発表者名: 園部円、渡邉則幸、鈴木貴也、小柳円、有村裕、相崎英樹、村松正道、脇田隆字
  • 学会等名: 第69回日本ウイルス学会学術集会
• [学会発表] ラット肝炎ウイルス感染動物モデルを用いたC型肝炎ウイルスワクチン開発 (2022)
  • 著者名/発表者名: 渡邉則幸、園部円、鈴木貴也、李天成、須崎百合子、網康至、花木賢一、小柳円、有村裕、鈴木亮介、相崎英樹、村松正道、脇田隆字
  • 学会等名: 第26回日本ワクチン学会学術集会
• [図書] 日本の感染症―明らかにされたこと残された課題 (2022)
  • 著者名/発表者名: 相崎英樹
  • 総ページ数: 22
  • 出版者: 南山堂
• [図書] 臨床消化器内科Vol.37 No.9 (2022)
  • 著者名/発表者名: 相崎英樹、青柳東代、杉山真也、村松正道、溝上雅史、脇田隆字
  • 総ページ数: 6
  • 出版者: 日本メディカルセンター