CCR欠損マウスにおける腸炎の病態解明と腸管Th17細胞の機能的分類法の確立

2022 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 21K07984
• 研究機関: 大分大学
• 研究代表者: 小林 隆志 大分大学, 医学部, 教授 (30380520)
• 研究分担者: 村上 和成 大分大学, 医学部, 教授 (00239485) ; 小坂 聡太郎 大分大学, 医学部, 助教 (60835700)
• 研究期間 (年度): 2021-04-01 – 2024-03-31
• キーワード: ケモカイン受容体 / ゲノム編集マウス / Th17細胞 / 炎症性腸疾患 / 疾患モデルマウス / CCR6 / CCR2

研究実績の概要

本研究の目的は、ケモカイン受容体に着目して感染防御を担うTh17細胞と免疫寛容を担うTh17細胞を識別する方法を確立することである。
昨年度、腸炎の病態形成に働くケモカインとTh17細胞を明らかにするため、マウスにDSSを投与して実験的大腸炎を誘導した。その結果、野生型マウスやCCR2欠損マウスに比べCCR6欠損マウスで重症化した腸炎が、CCR2/6二重欠損マウスでは有意に軽症化することを見出した。本年度、この原因を解明するためさらなる解析を進めた。まず、CCR6単独の欠損で重症化した実験的腸炎が、CCR2阻害剤を投与することで軽症化することを見出した。つまり、CCR2/6のシグナルが薬理学的に遮断されても腸炎が軽症化することが示された。一方、野生型マウスに腸炎を誘導すると、大腸粘膜固有層においてケモカインCCL7, CCL8, およびCCL20の発現が上昇し、CCR2シングル陽性Th17（CCR2+Th17）細胞、CCR6シングル陽性Th17（CCR6+Th17）細胞、およびCCR2/6ダブル陽性Th17（CCR2+/6+Th17）細胞が集積することを見出した。フローサイトメトリー解析によりCCR2+/6+Th17細胞は他のTh17サブセットに比べGM-CSFの産生能が高いことがわかった。興味深いことに、CCR2/6二重欠損マウスの大腸ではGM-CSFの発現レベルが有意に低下していた。従って、CCR2+/6+Th17細胞が腸炎増悪に寄与する炎症性Th17細胞であることが示唆された。この研究成果は学術論文として国際誌に公表した。
CCR6+Th17細胞が免疫寛容を担い、CCR2+/6+Th17細胞が炎症を惹起するという仮説を立てて、各Th17サブセットをセルソーターで分離し、遺伝子発現パターンを解析したり、細胞を腸炎モデルマウスに移入して病態変化を観察したりする予定である。

現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

今年度は、CCR6欠損マウスで重症化する腸炎が、CCR2/6二重欠損マウスで軽症化する原因を解析したところ、実験的腸炎の誘導によって大腸粘膜固有層にGM-CSFを高発現するCCR2+/6+Th17細胞が集積していることと、CCR2/6二重欠損マウスの腸管組織でGM-CSFの発現が低下していることを明らかにした。このことから、CCR2+/6+Th17細胞が腸炎増悪に寄与する炎症性Th17細胞であることが示唆され、新たな炎症性Th17細胞の識別法の確立が期待される。これらの成果を学術論文として国際誌に公表できたことから当初の計画以上に進んでいると考えている。

今後の研究の推進方策

CCR6単独欠損マウスとCCR2/6二重欠損マウスの腸炎の表現型より、炎症性Th17細胞はCCR2+/6+Th17細胞で、免疫抑制性Th17細胞はCCR6+Th17細胞ではないかという着想を得た。今後、DSS腸炎を誘導したマウスの腸管粘膜固有層に集積したTh17細胞サブセットを回収して、マイクロアレイで遺伝子発現パターンを網羅的に解析し、各Th17サブセットに特徴的な遺伝子を同定する。Th17細胞をCCR2とCCR6の各発現パターンをもとにセルソーターでCCR2+/6+Th17細胞とCCR6+Th17細胞を分離回収しmRNAを抽出する。
さらに、上述の方法で回収した各Th17サブセットをレシピエントマウスに移入して腸炎やその他の臓器の炎症性疾患の病態に変化がみられるか観察する。例えば、CCR2+/6+Th17細胞を炎症モデルマウスに移入して、強い炎症を惹起できるのか検討したり、CCR6+Th17細胞を移入して病態を改善できるか検討する。
さらに、CCR6+Th17細胞特有の免疫抑制分子が見つかれば、その組換えタンパク質を炎症モデルマウスに投与して病態が改善できるのか検討する。最後に、研究成果を取りまとめ、学術論文に発表する。

次年度使用額が生じた理由

腸管組織のTh17サブセットの解析が順調に進んでいるため、経費を節約することができた。これは、大阪大学茂呂教授にご教示いただいたプロトコールにより、粘膜固有層から安定的にリンパ球を分離できるようになったことが経費の節約につながったと考えられる。尚、繰越金は請求した助成金と合わせ、主に消耗品および実験動物飼育管理費等として次年度に使用する予定である。

研究成果

• [雑誌論文] CCL20/CCR6 chemokine signaling is not essential for pathogenesis in an experimental autoimmune encephalomyelitis mouse model of multiple sclerosis (2023)
  • 著者名/発表者名: Sachi Nozomi、Kamiyama Naganori、Saechue Benjawan、Ozaka Sotaro、Dewayani Astri、Ariki Shimpei、Chalalai Thanyakorn、Soga Yasuhiro、Fukuda Chiaki、Kagoshima Yomei、Ekronarongchai Supanuch、Kobayashi Takashi
  • 雑誌名: Biochemical and Biophysical Research Communications 巻: 641 ページ: 123～131
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2022.11.088
  • 査読あり
• [雑誌論文] GM-CSF-producing CCR2+ CCR6+ Th17 cells are pathogenic in dextran sodium sulfate-induced colitis model in mice (2023)
  • 著者名/発表者名: Ariki Shimpei、Ozaka Sotaro、Sachi Nozomi、Chalalai Thanyakorn、Soga Yasuhiro、Fukuda Chiaki、Kagoshima Yomei、Ekronarongchai Supanuch、Mizukami Kazuhiro、Kamiyama Naganori、Murakami Kazunari、Kobayashi Takashi
  • 雑誌名: Genes to Cells 巻: 28 ページ: 267～276
  • DOI: 10.1111/gtc.13008
  • 査読あり
• [雑誌論文] Toxoplasma IWS1 Determines Fitness in Interferon-γ-Activated Host Cells and Mice by Indirectly Regulating ROP18 mRNA Expression. (2023)
  • 著者名/発表者名: Hashizaki Emi、Sasai Miwa、Okuzaki Daisuke、Nishi Tsubasa、Kobayashi Takashi、Iwanaga Shiroh、Yamamoto Masahiro
  • 雑誌名: mBio 巻: 14 ページ: e0325622
  • DOI: 10.1128/mbio.03256-22
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Involvement of clusterin expression in the refractory response of pancreatic cancer cells to a MEK inhibitor (2023)
  • 著者名/発表者名: Amada K, Hijiya N, Ikarimoto S, Yanagihara K, Hanada T, Hidano S, Kurogi S, Tsukamoto Y, Nakada C, Kinoshita K, Hirashita Y, Uchida T, Shin T, Yada K, Hirashita T, Kobayashi T, Murakami K, Inomata M, Shirao K, Aoki M, Takekawa M, Moriyama M.
  • 雑誌名: Cancer Science 巻: Online ahead of print. ページ: -
  • DOI: 10.1111/cas.15735
  • 査読あり
• [雑誌論文] TRAF6 signaling pathway in T cells regulates anti-tumor immunity through the activation of tumor specific Th9 cells and CTLs (2022)
  • 著者名/発表者名: Dewayani Astri、Kamiyama Naganori、Sachi Nozomi、Ozaka Sotaro、Saechue Benjawan、Ariki Shimpei、Goto Mizuki、Chalalai Thanyakorn、Soga Yasuhiro、Fukuda Chiaki、Kagoshima Yomei、Maekawa Yoichi、Kobayashi Takashi
  • 雑誌名: Biochemical and Biophysical Research Communications 巻: 613 ページ: 26～33
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2022.04.125
  • 査読あり
• [雑誌論文] Saireito, a Japanese herbal medicine, alleviates leaky gut associated with antibiotic-induced dysbiosis in mice (2022)
  • 著者名/発表者名: Ozaka S、Sonoda A、Ariki S、Minata M、Kamiyama N、Hidano S、Sachi N、Ito K、Kudo Y、Dewayani A、Chalalai T、Ozaki T、Soga Y、Fukuda C、Mizukami K、Ishizawa S、Nishiyama M、Fujitsuka N、Mogami S、Kubota K、Murakami K、Kobayashi T
  • 雑誌名: PLOS ONE 巻: 17 ページ: e0269698
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0269698
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Comprehensive lipidomics of lupus-prone mice using LC-MS/MS identifies the reduction of palmitoylethanolamide that suppresses TLR9-mediated inflammation (2022)
  • 著者名/発表者名: Ozaki T、Kamiyama N、Saechue B、Soga Y、Gotoh R、Nakayama T、Fukuda C、Dewayani A、Chalalai T、Ariki S、Ozaka S、Sonoda A、Hirose H、Gendo Y、Noguchi K、Sachi N、Hidano S、Maeshima K、Gotoh K、Masaki T、Ishii K、Osada Y、Shibata H、Kobayashi T
  • 雑誌名: Genes to Cells 巻: 27 ページ: 493～504
  • DOI: 10.1111/gtc.12944
  • 査読あり
• [雑誌論文] Transcriptional coregulator Ess2 controls survival of post-thymic CD4+ T cells through the Myc and IL-7 signaling pathways (2022)
  • 著者名/発表者名: Takada Ichiro、Hidano Shinya、Takahashi Sayuri、Yanaka Kaori、Ogawa Hidesato、Tsuchiya Megumi、Yokoyama Atsushi、Sato Shingo、Ochi Hiroki、Nakagawa Tohru、Kobayashi Takashi、Nakagawa Shinichi、Makishima Makoto
  • 雑誌名: Journal of Biological Chemistry 巻: 298 ページ: 102342～102342
  • DOI: 10.1016/j.jbc.2022.102342
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Acute Cholecystitis Associated with Eosinophilic Granulomatosis with Polyangiitis that Responded to Glucocorticoid Therapy (2022)
  • 著者名/発表者名: Ozaka Sotaro、Kodera Takamoto、Tsutsumi Koshiro、Fukuda Masahide、Iwao Masao、Hirashita Yuka、Takahashi Haruhiko、Fukuda Kensuke、Okamoto Kazuhisa、Arakawa Mie、Ogawa Ryo、Endo Mizuki、Mizukami Kazuhiro、Okimoto Tadayoshi、Kamiyama Naganori、Kodama Masaaki、Kobayashi Takashi、Murakami Kazunari
  • 雑誌名: Internal Medicine 巻: Online ahead of print. ページ: -
  • DOI: 10.2169/internalmedicine.0437-22
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] COVID-19 vaccination and liver disease (2022)
  • 著者名/発表者名: Ozaka Sotaro、Kobayashi Takashi、Mizukami Kazuhiro、Murakami Kazunari
  • 雑誌名: World Journal of Gastroenterology 巻: 28 ページ: 6791～6810
  • DOI: 10.3748/wjg.v28.i48.6791
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Physiological function of chemokine CCL20 and its receptor CCR6 in multiple sclerosis in mice (2022)
  • 著者名/発表者名: Nozomi Sachi, Naganori Kamiyama, Sotaro Ozaka, Shimpei Ariki, Thanyakorn Chalalai, Yomei Kagoshima, Takashi Kobayashi
  • 学会等名: 第51回日本免疫学会学術集会
• [学会発表] Zika virus induces pathogenic T cell-attracting chemokines in the central nervous system and exacerbates experimental autoimmune encephalomyelitis (2022)
  • 著者名/発表者名: Naganori Kamiyama, Thanyakorn Chalalai, Sotaro Ozaka, Shimpei Ariki, Yomei Kagoshima, Nozomi Sachi, Takashi Kobayashi
  • 学会等名: 第51回日本免疫学会学術集会
• [学会発表] Secretory leukocyte protease inhibitor ameliorates murine experimental colitis by protecting the intestinal epithelial barrier (2022)
  • 著者名/発表者名: Sotaro Ozaka, Shimpei Ariki, Yomei Kagoshima, Naganori Kamiyama, Nozomi Sachi, Thanyakorn Chalalai, Astri Dewayani, Takashi Kobayashi
  • 学会等名: 第51回日本免疫学会学術集会
• [学会発表] Physiological relevance of TRAF6 signaling in dendritic cells in controlling C. rodentium infection (2022)
  • 著者名/発表者名: Thanyakorn Chalalai, Naganori Kamiyama, Shimpei Ariki, Sotaro Ozaka, Nozomi Sachi, Yomei Kagoshima, Ryu Okumura, Kiyoshi Takeda, Takashi Kobayashi
  • 学会等名: 第51回日本免疫学会学術集会
• [学会発表] Identification of pathogenic Th17 cells in gastrointestinal tract using chemokine receptor deficient mice (2022)
  • 著者名/発表者名: Shimpei Ariki, Sotaro Ozaka, Nozomi Sachi, Yomei Kagoshima, Thanyakorn Chalalai, Naganori Kamiyama, Takashi Kobayashi
  • 学会等名: 第51回日本免疫学会学術集会
• [学会発表] Functional analysis of chemokine receptor CCR2 in a murine congenital toxoplasmosis model (2022)
  • 著者名/発表者名: Noganori Kamiyama, Nozomi Sachi, Sotaro Ozaka, Shimpei Ariki, Thanyakorn Chalalai, Yasuhiro Soga, Chiaki Fukuda, Yomei Kagoshima, Supanuch Ekronarongchai, Masahiro Yamamoto, Takashi Kobayashi
  • 学会等名: 第15回寄生虫感染免疫研究会
• [学会発表] Secretory leukocyte protease inhibitor ameliorates experimental colitis by protecting the intestinal epithelial barrier (2022)
  • 著者名/発表者名: Sotaro Ozaka, Shimpei Ariki, Naganori Kamiyama, Yomei Kagoshima, Nozomi Sachi, Thanyakorn Chalalai, Yasuhiro Soga, Kazuhiro Mizukami, Kazunari Murakami, Takashi Kobayashi
  • 学会等名: 第12回 癌・炎症と抗酸化研究会