| 研究課題/領域番号 |
21K08040
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| 研究機関 | 東京女子医科大学 |
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研究代表者 |
西井 明子 (関明子) 東京女子医科大学, 医学部, 教授 (80408608)
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| 研究分担者 |
羽山 恵美子 東京女子医科大学, 医学部, 非常勤講師 (00349698)
古谷 喜幸 東京女子医科大学, 医学部, 非常勤講師 (10424673)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | ギャップジャンクション / iPS細胞由来心筋細胞 / 電気生理学的性質 |
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| 研究実績の概要 |
コネキシン45（Cx45）は、胎生期の心臓で最初に発現するCxである。出生後はその発現部位が刺激伝導系に限局し、構成するチャネルの単位電流は、心筋細胞に発現する別のコネキシン、Cx43やCx40よりも小さく、その役割については不明な点が多く、遺伝子異常の報告もなかった。本研究の目的は、我々が最近発見した、家族性の心臓伝導障害と骨・歯牙異常を呈する家族で発見されたCx45R75H変異の機能を調べ、その病態機序を解明し、治療につなげることである。
本年度は、患者3症例と健常者複数のiPS細胞について、複数のサブ系列のiPS細胞を樹立し、個別に培養維持し、心筋細胞への分化し易さの検討を行い、心筋細胞への分化に向くサブ系列を決定した。さらに、健常者iPS細胞のコネキシン遺伝子のノックアウト、患者iPS細胞のコネキシン45のR75H（G224A）変異の修復、健常者iPS細胞のコネキシン遺伝子にG224A変異の導入を目的として、ゲノム編集実験を進めた。これまでに、コネキシン遺伝子の所定の位置でゲノムを切断するためのガイドになるgRNAと切断酵素であるCas9を発現するプラスミドコンストラクトを作成し、これを用いて健常者コネキシン45遺伝子のノックアウト（11塩基の欠損）iPS細胞を得た。現在、患者iPS細胞のコネキシン45のG224A変異の修復、健常者iPS細胞のコネキシン遺伝子にG224A変異の導入のための１塩基置換をターゲットとしたゲノム編集実験を進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は、iPS細胞から心筋分化への方法の検討を進めた。患者iPS細胞の複数のサブ系列細胞の中から、比較的分化しやすい系列を選別できた。ゲノム編集法にも習熟し、実際に健常者コネキシン45遺伝子のノックアウトiPS細胞を得ることができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
最終年度は、コネキシン変異を持つ3名の患者のiPS細胞、ゲノム編集したiPS細胞、健常者由来iPS細胞を心筋細胞へ誘導し、主にMED64システムを用いて、機能の違いを検討する予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本来今年度中に実施予定であった、ゲノム編集実験やiPS心筋細胞の誘導などが一部遅れたため。
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