| 研究課題/領域番号 |
21K08141
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| 研究機関 | 京都薬科大学 |
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研究代表者 |
小原 幸 京都薬科大学, 薬学部, 准教授 (80275198)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | ミトコンドリア / 心不全 |
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| 研究実績の概要 |
本年度は新生仔ラット培養心筋細胞を用いた検討を行った。細胞外ミトコンドリアに関する実験の事前検討として、心筋細胞の障害系の確立と、ミトコンドリア損傷を検討した。低酸素・再酸素化による心筋細胞障害を行い、細胞内ミトコンドリア障害に対するホノキオールやGLP1作動薬の細胞内ミトコンドリア保護を介した心筋細胞保護作用を検討した。GLP1作動薬は低酸素・再酸素化による心筋細胞ネクローシスや、ミトコンドリア経路を介したアポトーシスを軽減し、ミトコンドリア融合に導く品質管理因子の保持に続きATP産生能を保持していた。またホノキオールは同じく低酸素・再酸素化障害においてミトコンドリアのサーチュイン3を保持することによりMnSODをアセチル化し、ミトコンドリア機能を保持していた。
細胞外ミトコンドリア放出を検討するため、ミトコンドリア内チトクロームCの、培養溶液中への放出を検討するため、吸光度による検出を既報をもとに行った。界面活性剤で処理した培養細胞上清を陽性コントロールとして、アッセイ系を確立した。
上記で示した低酸素・再酸素化刺激に加え心不全時に重要な働きをするアンジオテンシンIIを投与した心筋培養細胞の細胞上清を採取し、細胞及びデブリスを遠心にて取り除いた。細胞除去後の培養上清において、チトクロームC放出を吸光度で検討したが、障害の程度が軽度であったためか、濃度が薄く信頼性に足りる吸光度結果を得られなかった。今後、保存しているサンプルを再度16000gで遠心し、ペレットとしてミトコンドリアを濃縮しチトクロームC放出の検討及びミトトラッカーによる染色等を行っていく予定をしている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
今年度は心筋培養細胞を用いた検討を行った。培養細胞に障害を付与し、細胞内ミトコンドリア機能解析、及び細胞外ミトコンドリア放出を検討した。COVIDの関係で、研究室の入室人数に制限があり、培養実験が予定通り行えなかった。また、細胞外ミトコンドリア放出の検討として、吸光度によるチトクローム検出を試みたが、陽性コントロール実験では検出可能であったものの、心筋障害モデルでの検出は困難で、今後検体の濃縮による検出感度を上げる試みを行うとともに、ミトコンドリア特異染色を用いた検出法を行っていく予定をしている。
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| 今後の研究の推進方策 |
引き続き培養心筋細胞に対する障害負荷を行い、培養上清に対するミトコンドリア放出の検出を行う。培養細胞上清を遠心し、ペレット内の単体ミトコンドリア・封入小胞の有無を、チトクロームCの吸光度測定及び、Mitotracker Red及び脂質膜染色試薬PKH67を用いFACSで解析する。
さらに、回収された細胞外ミトコンドリアの酸化障害レベルを過酸化脂質レベルで検討する。予定していたMitoSOXが共焦点レーザー顕微鏡の搭載レーザーの関係で使用できなくなったため、代わりに一重酸素染色によるミトコンドリアROS産生を検討して確認し障害惹起誘導体となる可能性を推測する。
細胞外ミトコンドリアの、心筋細胞及び他細胞系への影響を検討するため、心筋培養に低酸素再酸素化刺激を与えた後培養上清よりミトコンドリア含有ペレットを回収した後、磁気ビーズ結合抗Tom22抗体を用いて、ミトコンドリア単体、封入小体を回収する。回収細胞外ミトコンドリアを心筋細胞、線維芽細胞、骨格筋(芽)細胞培養の培養上清に添加し、細胞障害を惹起するか否かをLDH放出レベル及びpropidium Iodide染色による細胞生存率の検討で行う。これらにより心筋障害時放出されるミトコンドリア単体及び封入小胞が心組織内でオートクリン、パラクリン的に細胞障害に関わるか、また臓器を超えた全身的影響として、サルコペニアの進展にも直接関与し得るかどうかを明らかにすることができる。
さらにin vivo心不全モデルにおいても、血中の放出ミトコンドリアをin vitroと同様の系で検出可能かどうかを検討し、臓器連関の障害因子としての可能性を探索する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度COVIDの関係で、研究の進行にやや遅れが生じたため、動物の購入数が予定より少なくなった。これに関連し、抗体や特異染色試薬などの購入を見送り、次年度としたため次年度の使用額が生じた。
研究活動もおおむね通常となっており、購入を先延ばししていた抗体試薬、染色試薬の購入が必要となる。また、細胞外ミトコンドリアの回収のため、ビーズを用いたソーティングの系の確立と、これを行う関連試薬等を購入する必要がある。また、細胞外ミトコンドリアのバラクライン作用確認のため、心筋細胞のみでなく、骨格筋芽細胞、線維芽細胞の培養も開始するため、これらの細胞培養関連試薬が必要となり購入を行い、研究をすすめる予定をしている。
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