| 研究課題/領域番号 |
21K08141
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| 研究機関 | 京都薬科大学 |
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研究代表者 |
小原 幸 京都薬科大学, 薬学部, 准教授 (80275198)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | ミトコンドリア / 心不全 |
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| 研究実績の概要 |
本年度も、引き続き新生仔ラット培養心筋細胞からの細胞外ミトコンドリア放出と放出ミトコンドリアの障害について検討した。新生仔ラット培養心筋細胞に低酸素再酸素化(H/R)刺激を行い、培養上清を回収した。昨年度培養上清中へのミトコンドリアタンパク放出を認めたため、H/R刺激後の培養上清より遠心分離法でミトコンドリアの分画を得て、新たな培養心筋細胞上清に加えたところ、濃度依存的に細胞壊死を導いた。さらに、H/R刺激以外にミトコンドリア放出に関わる刺激系の探索として心不全時に増加するノルエピネフリン刺激を行った。24時間刺激では、細胞死の誘発無しにミトコンドリアタンパクの放出を認めたが、より長期では未刺激群との差が認められなくなった。長期培養そのものによる細胞傷害のため、エピネフリンの影響が隠された可能性を考えている。
引き続き、心筋細胞株であるH9C2細胞を用いてもH/R刺激およびサイトカイン刺激によるミトコンドリア放出を検討した。H/R刺激は新生仔ラット培養心筋細胞と同様の低酸素刺激では、細胞死を誘導せず培養上清のLDHを増加させなかった。この刺激系において、上清中へのミトコンドリア放出は認めなかった。他施設からの報告を参考に、H/Rに用いる培養液をグルコースフリーとしたところ有意な細胞死を誘導しえた。サイトカイン投与系として、アンジオテンシンII(100 nM)、ノルエピネフリン(1 μM)を24時間刺激した。培養上清を濃縮し、Western blotで同様に検討したところ、ノルエピネフリンではミトコンドリア放出の誘導は認めなかったが、アンジオテンシンII刺激では明らかな放出誘導が認められた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
今年度は培養細胞実験を２種類の心筋培養細胞系で行った。昨年度ミトコンドリア封入エキソソームの培養上清への放出検討を行ったが、検出が難しく今年度は単体ミトコンドリアの放出を主に検討した。心不全関連神経体液性因子の中で、アンジオテンシンIIがミトコンドリア放出を有意に誘導することを見出した。今年度から導入したH9C2細胞株は初代培養心筋細胞と異なり、大量培養が可能な細胞系であり、昨年度断念したエキソソーム封入ミトコンドリアの放出検索に向けての準備を進めている。また、細胞外放出ミトコンドリアの骨格筋細胞へのバラクリン作用を検討するため、骨格筋細胞培養の準備を進めているが手続きに時間がかり、全体の進行がやや遅れた。
但し、単体としてのミトコンドリア放出をアンジオテンシンIIが誘導することを見出し、放出ミトコンドリア分画を加えた培養上清による心筋細胞障害性を見出せたため、今後放出ミトコンドリアの性状をより詳細に検討し、骨格筋細胞に対する細胞障害性をin vitro培養系で確認するとともに、in vivo実験を行っていく予定でいる。
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| 今後の研究の推進方策 |
障害培養心筋において、ミトコンドリア単体での細胞外放出が認められ、放出ミトコンドリア分画にバラクリン作用として心筋細胞障害性を見出せた。今年度はH9C2を導入し、同様の検討を行い、概ね新生仔ラット心筋細胞と同様の結果を得た。H9C2細胞は大量培養が可能であり、昨年度培養可能細胞数の関係で検出できなかった、エキソソーム含有ミトコンドリアの心筋障害時細胞外放出の有無を再度検討する。さらに、放出ミトコンドリアの細胞障害惹起機序を検討するため、ミトコンドリア活性酸素種産生能を検討し裸体ミトコンドリアDNAの含有の可能性をPCRで検討する。また、細胞間・臓器間の障害惹起の有無を検討するため、放出ミトコンドリアを線維芽細胞や骨格筋細胞に投与し細胞毒性を検討する。
昨年度が最終年度であったが、放出ミトコンドリアのバラクリン作用とin vivoにおける検討に至らなかったため、研究期間の延長としており、本年度、心筋梗塞モデルと大動脈縮窄による圧負荷肥大心を作成し、血中へのミトコンドリア放出量の増加を検討する。また放出ミトコンドリアによる心筋及び骨格筋細胞への障害の有無を培養細胞への添加実験で検討する。さらにミトコンドリア放出を来す心不全モデルにおける、骨格筋障害を評価し、中和抗体による放出ミトコンドリア除去が骨格筋障害を軽減するか否かを検討する。また心不全動物の血液検体からビーズソーティングで回収したミトコンドリアを健常ラットに投与し、心筋骨格筋障害の誘導の有無を検討し、成果を論文化していく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度新たにH9C2細胞培養実験を開始したため、バラクリン作用の検討と、成獣を使った実験に至らなかった。そのため、成獣実験で予定していた抗体等の試薬の購入を見送り、研究期間の延長、次年度使用とした。H9C2細胞を用いた、エキソソ－ム含有ミトコンドリアの検討にエキソソーム採取試薬が必要となり、導入する線維芽細胞と骨格筋細胞の培養実験に関する試薬が必要となる。また先延ばししていた抗体試薬、ビーズソーティング関連試薬を購入し成獣での検討をすすめていく予定をしている。
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