| 研究課題/領域番号 |
21K08235
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| 研究機関 | 杏林大学 |
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研究代表者 |
上野 仁之 杏林大学, 医学部, 講師 (30586251)
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| 研究分担者 |
長瀬 美樹 杏林大学, 医学部, 教授 (60302733)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | podocyte / kinesin / myosin / morphology / foot process |
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| 研究実績の概要 |
ポドサイトの障害は蛋白尿や糸球体硬化症を引き起こし、その形態機能制御はCKD治療の観点から重要である。細胞形態の形成や維持には細胞骨格とその上を滑走するモータータンパク質が重要である事が知られているが、ポドサイトにおいてはまだ分かっていない事が多い。本年度はミオシンとキネシンについて糸球体を中心とした腎臓での局在を調べ、解析を進める分子の決定を行った。
ミオシンに関してはポドサイトに発現していると考えられるMyo1B、Myo5C、Myo10の腎臓のクライオ切片とパラフィン切片を用い免疫組織化学を行った。Myo1Bの発現は糸球体では弱いようであった。Myo5Cは全体的に染色された。Myo10は糸球体の表層近くではときおり強いドット状の蛍光が観測された。Myo10はフィロポディアの先端に集まる事が知られているため、ポドサイトでも足突起の先に局在し、足突起の伸長に関係しているのではないかと考えられる。
キネシンに関してもポドサイトに発現していると考えられるKIF23、KIF24の観察を行った。KIF23は染色が弱く考えていたより糸球体での発現量は少なそうだった。KIF24は所々にドット状の染色が見られ、おそらく成熟したポドサイトの中心体に局在しているのではないかと考えられた。ポドサイトは成熟する過程で一次繊毛が消失知られている事が知られており、KIF24がその現象に関わっているのではないかという事が示唆される。
今後はMyo10とKIF24の解析を中心に行い、合わせて他の分子の解析も継続する。
現在は培養細胞の蛍光抗体染色や蛍光分子をつけたモーターを発現させて細胞内局在の観察をする準備を行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ミオシンとキネシンの糸球体での局在の確認はおわり、解析を本格的に行うモーター分子を絞った。中心体に集まりリモデリングする分子もあり、成熟するにつれて繊毛が消失する事が知られているポドサイトにおいてあたらしい形態制御機構などの発見が期待される。またフィロポディアの伸長をする分子もあり、足突起の伸長にも関係している可能性がある。
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| 今後の研究の推進方策 |
培養細胞を使い、ポドサイトの分化前と分化後にどのような局在に変わるかを確認する予定である。また細胞内局在のとEGFPをつけたモーターの動きを観察するため、ベクターの準備をしている。さらに、突起形成・退縮過程での局在の変化とモーターの動きを解析する。iPS細胞のポドサイトへの分化過程、分化後、メカニカルストレスを加えた系でも同様の解析を行う。さらにCRISPR/Cas9をを用い、当該分子モーターのKO細胞株やIPS細胞を作製し、ポドサイトに分化させてポドサイトの形態と障害後の足突起の再形成能を解析する。
アドリアマイシン腎症マウス、protamine sulfate/heparin sulfate灌流マウスなどのポドサイト障害モデルや可逆的足突起消失モデルを作製し、足細胞障害時や足突起退縮・形成過程において、分子モーターと細胞骨格がどのように変容するか解析する。
Yeast two hybrid法を用いて結合タンパクを同定する。さらにシグナル経路の上流・下流因子を探索してポドサイト形態形成における分子連関を解明する。ポドサイトの他の重要なタンパク質との関係が分かることによりその機能や制御などが分かる可能性も考えられる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
学会のオンライン化により旅費の削減。コロナの影響による大学業務の増加、子供のコロナ感染によって濃厚接触者になり自宅待機などが一ヶ月以上あったため、少し動物の購入やベクターなどの試薬購入が遅れている。特に研究内容に影響はない為、今年度に予定通り研究を行う事により、適切に使用する予定である。
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