| 研究課題/領域番号 |
21K08259
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| 研究機関 | 京都府立医科大学 |
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研究代表者 |
中島 由郎 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (30455430)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | ネフロン癆 / 一次線毛 / ANKS6 / リン酸化 / 嚢胞腎 |
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| 研究実績の概要 |
細胞内小器官である一次線毛の欠失や構造・機能異常は腎臓のみならず、多くの組織・器官に異常をもたらす。ネフロン癆の責任遺伝子産物（NPHP）は、主に一次線毛に局在する。最近、研究代表者はNPHPの一種であるANKS６（NPHP16） のリン酸化がネフロン癆モデルマウスの腎臓で阻害されていることを報告した。ネフロン癆発症機序の解明を目的としてANKS６ のリン酸化の意義を明らかにするために、まずリン酸化されているANKS６のアミノ酸残基を同定することを試みた。 樹立済みのマウス近位尿細管上由来の培養細胞（Dai1細胞）に対して、CRISPR/Cas9 システムを利用してANKS６遺伝子のN末端にPAタグを読み枠が合うようにデザインし、ゲノム編集を行なった。作製したPAタグN末端付加ANKS６ 安定発現細胞株から、タグに対する抗体で免疫沈降を行い、溶出液をSDS-PAGEで分離し、ゲルを銀染色した。その結果、分子量からANKS６と推測されるバンドが銀線色によって検出されたため、その部位のゲルを切り出し、理化学研究所に質量分析を依頼した。質量分析の結果、ANKS６の７３２番目のセリンをリン酸化部位として同定した。現在、ANKS６の７３２番目のセリンをアラニンに置換してリン酸化ができないアミノ酸変異（S７３２A）を導入したES細胞の作製を行なっているが、まだ成功していない。CRISPR/Cas9 システム以外のゲノム編集法についても検討し、アミノ酸変異（S７３２A）を導入したES細胞の作製、およびこの変異体ES細胞を用いてキメラマウスの作製を予定している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
三年目の研究計画は一年目に明らかにしたANKS6のリン酸化部位（S７３２）の生物学的意義を知るためにリン酸化できないアミノ酸変異（S７３２A）を導入して個体レベルで解析を行うことであった。ANKS６遺伝子への変異の導入はCRISPR/Cas9 システムを利用して行う。まずES細胞にS７３２Aのアミノ酸変異を導入し、そのANKS６変異体ES細胞とマウス胚からキメラマウスを作製する。現在、CRISPR/Cas9 システムによるES細胞へのアミノ酸変異導入を試みている段階である。具体的には、CRISPR/Cas9ベクターであるpX459に20mer標的配列に基づくオリゴヌクレオチド（sgRNA合成用）を挿入し、標的DNA切断プラスミドを構築した。次にS７３２A変異を導入するssDNAを合成し、構築した標的DNA切断プラスミドと一緒にES細胞にリポフェクションで遺伝子導入した。薬剤セレクションの結果、ES細胞をピックアップし、そのゲノム配列をDNA配列解析を行った。結果としてES細胞のゲノムDNAに対してCRISPR/Cas9による切断は確認できているが、S７３２A変異の導入に成功したES細胞は得られていない。結論としてANKS6遺伝子の７３２Aのアミノ酸変異を導入したES細胞の樹立に成功していないために研究計画が遅延している。
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| 今後の研究の推進方策 |
三年目の研究計画は、一年目に明らかにしたANKS6のリン酸化部位（S７３２）の生物学的意義を知るためにS７３２がリン酸化できないアミノ酸変異（S７３２A）を導入して個体レベルで解析を行うことである。現在、キメラマウスを作製するためにCRISPR/Cas9 システムによるES細胞へのアミノ酸変異導入を試みている段階であるが、S７３２Aのアミノ酸変異を導入したES細胞の樹立に成功していない。細胞に導入するプラスミドとssODNの量を検討するなどしたにも関わらず、部分的な配列の置換には成功しているが、完全な標的アミノ酸変異の導入ができていない。今後の対策としてアミノ酸変異導入にCRISPR/Cas9 システムと異なるゲノム編集法を試していきたい。TALEN（Transcription Activator-Like Effector Nucleases）もCRISPR/Cas9 システムと同様に特定のDNA配列を標的として選択的に切断し、遺伝子の挿入、削除、または置換を行うことができる先進的なゲノム編集ツールの一つである。TALENの利点として標的とするDNA配列に対して高い特異性を示し、オフターゲット効果（非標的領域への影響）が非常に低いことが知られている。このTALENを用いたゲノム編集により、マウスES細胞にANKS6遺伝子のS７３２Aアミノ酸置換を導入する。このS７３２Aアミノ酸置換が導入されたES細胞を用いてキメラマウスを作製する予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
アミノ酸変異を導入したES細胞の作製が遅延したため、その後の遺伝子改変マウスの作製が実行できておらず、その作製に関わる消耗品などの購入を控えた。今回、研究計画を見直し、研究を当初より一年間延長したため、次年度に行う実験等に使用する消耗品などのために次年度使用額が生じた。よって次年度には細胞培養及び、マウス作製などに関わる消耗品の購入を予定している。
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