多角的な研究方法による抗ラミニンガンマ１類天疱瘡の自己抗体の特異性と病原性の検討

2022 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 21K08331
• 研究機関: 大阪公立大学
• 研究代表者: 橋本 隆 大阪公立大学, 大学院医学研究科, 特任教授 (20129597)
• 研究分担者: TEYE KWESI 久留米大学, 付置研究所, 助教 (30599303) ; 立石 千晴 大阪公立大学, 大学院医学研究科, 准教授 (40597308) ; 石井 文人 久留米大学, 医学部, 准教授 (80330827) ; 鶴田 大輔 大阪公立大学, 大学院医学研究科, 教授 (90382043) ; 橋本 講司 東京大学, 大学院総合文化研究科, 助教 (90802702) ; 平田 央 大阪公立大学, 大学院医学研究科, 助教 (00464644)
• 研究期間 (年度): 2021-04-01 – 2024-03-31
• キーワード: 自己抗原 / 自己抗体 / 自己免疫水疱症 / ラミニンガンマ1 / p200 / ファージディスプレイ

研究実績の概要

自己免疫性水疱症は抗皮膚自己抗体によって皮膚・粘膜に水疱を形成する自己免疫性疾患で、現在多くの亜型が知られている。抗ラミニンγ1（p200）類天疱瘡はIgG抗p200蛋白/ラミニンγ1抗体を示す自己免疫性水疱症で、現在まで疾患モデルは確立されておらず、その病原性も解明されていない。本研究では、ラミニンγ１ノックアウトHaCaT細胞、ラミニンγ１リコンビナント蛋白、ファージディスプレイ法による病原性抗p200抗体作成、疾患モデル構築などの多角的研究により本疾患の病因解明を目指す。
当該年度中に大阪公立大学と久留米大学皮膚科で多くの自己免疫性水疱症症例の診断検査を施行し約20名の新たな抗ラミニンγ1類天疱瘡症例を渉猟した。また、p200蛋白/ラミニンγ１が、粘膜類天疱瘡のもう一つの自己抗原である可能性を検討し、英文論文として発表した。さらに、ラミニンγ１とラミニン332に対する自己抗原が共存する症例の存在も報告し、抗ラミニンγ１類天疱瘡が糖尿病治療薬であるDPP4阻害薬の薬疹として発症する可能性も発表した。上記の多くの検討から得られた抗ラミニンγ１類天疱瘡の情報を踏まえて新しい網羅的な自己免疫性水疱症の分類を提案し、和文および英文論文として発表した。
さらに、FOAM-LSCM蛍光抗体法を用いた研究により自己抗原の局在についてさらに詳細に検討し英文論文として発表した。また、CRISPR-Cas9法によりラミニンγ１をノックアウトした培養HaCaT細胞を用いた抗ラミニンγ１類天疱瘡の研究をOsaka City Med Jに論文発表した。
また、ラミニンα5が本疾患の新たな自己抗原の候補蛋白であることを見いだし論文発表した。さらに、ドイツのリューベック大学の研究者と、もう一つの新しい自己抗原の新規候補蛋白（未発表）について検討し、今後、各種の確認実験を行う予定である。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本研究の施行中に、さらに多くの新たな抗ラミニンγ1類天疱瘡症例を見出し、その患者の皮膚、血清、DNAなどの生体試料を保存したことは、今後の本研究に有用である。また、これらの患者の臨床的・免疫学的・生化学的検討から、抗ラミニンγ1類天疱瘡の新たな臨床的特徴（粘膜類天疱瘡と薬剤性自己免疫性水疱症など）を見出し、p200蛋白として、ラミニンγ１の他に、二つの新たな自己抗原の候補蛋白（ラミニンα5ともう一つの未発表の新規抗原候補蛋白）を見出したことは、今後の本研究の推進に役立つ。また、今までの研究の過程で得られた、ラミニンγ１ノックアウト培養細胞実験の結果、多くの臨床的研究、自己抗原の解析、新しい網羅的な自己免疫性水疱症の分類などの多くの研究結果を、主に英文論文として発表した。
また、本研究のラミニンγ１ノックアウト培養細胞実験研究の副産物として、各種の培養細胞が、皮膚の成熟ラミニンγ１より小さい分子量のラミニンγ１を発現していることが判明した。そのため、今後、これらの培養細胞の産生する小型のラミニンγ１の性質、特にその糖鎖形成について詳細に検討し、なぜラミニンγ１が全身の臓器の基底膜に存在するのに患者自己抗体が皮膚のみに病変を生じるかという問いに回答したい。
この間に、より感度の高いラミニンγ１リコンビナント蛋白によるELISA法の確立を進め、そのため、自動ELISA洗浄装置を購入した。今後、このELISA法を、ラミニンα5ともう一つの新規抗原候補蛋白のELISA法の開発にも応用する。また、必要な実験器具と実験試料を購入して、ファージディスプレイ法によるモノクローナル抗体の作成の準備を進めた。しかしながら、研究分担者の橋本講司が今年度中に名古屋大学理学部から東京大学理学部に移動したため、ファージディスプレイ法研究に若干の遅れを生じた。

今後の研究の推進方策

今後も多数の自己免疫性水疱症症例の診断検査を継続し、新たな抗ラミニンγ1/p200類天疱瘡症例を渉猟し、その臨床情報と各種生体試料を保存を継続する。また、抗ラミニンγ１類天疱瘡自己抗体のより簡便で特異的な検出法として、ラミニンγ１リコンビナント蛋白を用いたELISA法の確立を進める。
前年度までの研究から、抗ラミニンγ1類天疱瘡の自己抗原として、ラミニンγ1の他に、ラミニンα5ともう一つの新規自己抗原の候補蛋白（未発表）が示唆されたため、今後、これらの新たな2蛋白についても、そのリコンビナント蛋白の作成とそれを用いた免疫ブロット法やELISA法の確立を進める。同時に、ラミニンα5ともう一つの新規自己抗原の候補蛋白について、皮膚基底膜部の接着における生理的な機能を各種生化学的・細胞生物学的手法を用いて検討する。さらに、これらの２蛋白の遺伝子異常による皮膚疾患は知られていないため、現在までその原因遺伝子が未知である先天性表皮水疱症患者の遺伝子検査を進め、これらの2蛋白の遺伝子異常による新たな皮膚疾患の同定を試みる。
疾患モデル実験に使用する大量の病原性抗ラミニンγ１抗体を得るため、抗ラミニンγ１類天疱瘡患者B細胞を用いたファージディスプレイ法によりラミニンγ１に対する病原性モノクローナル抗体作成の実験をさらに迅速に進める。さらに、ラミニンγ１の他に、ラミニンα5、また現在検討中の新しい自己抗原の候補蛋白についても、ファージディスプレイ法により病原性モノクローナル抗体を作成する予定である。
最終的に、作成した病原性ヒト型モノクローナル抗体を用いて、抗ラミニンγ1/p200類天疱瘡の疾患モデルとして、ex vivoヒト皮膚切片疾患モデルと新生マウス動物疾患モデルの手技を確立し、作成したヒト型モノクローナル抗体の病原性の確認実験を行う。

次年度使用額が生じた理由

次年度使用額が生じた理由は、当該年度に使用する予定であったファージディスプレイ用の各種の試薬を当該年度に購入しなかったため、それらの試薬を次年度に購入するためである。

研究成果

• [雑誌論文] Potential contribution of anti-p200 autoantibodies to mucosal lesions in anti-p200 pemphigoid (2023)
  • 著者名/発表者名: Gao Y, Qian H, Hashimoto T, Li X
  • 雑誌名: Front Immunol 巻: 14 ページ: 1118846
  • DOI: 10.3389/fimmu.2023.1118846
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Anti-β4 integrin autoantibodies in patients with mucous membrane pemphigoid: a retrospective analysis from a tertiary centre in Italy (2023)
  • 著者名/発表者名: Maglie R, De Almeida CV, Baffa ME, Bianchi B, Caproni M, Di Zenzo G, Li X, Hirako Y, HashimotoT, Tusa I, Lulli M, Rovida E, Antiga E
  • 雑誌名: J Eur Acad Dermatol Venereol 巻: 37(2) ページ: e249-e251
  • DOI: 10.1111/jdv.18617
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Case Report: Mucous membrane pemphigoid with complicated autoantibody profile indicating the necessity of comprehensive diagnostic methods and the contribution of IgA autoantibodies (2023)
  • 著者名/発表者名: Liu W, Li H, Jin Y, Cheng L, She L, Gao Y, Zhou Z, Feng S, Qian H, Hashimoto T, Li X
  • 雑誌名: Front Immunol 巻: 14 ページ: 1149119
  • DOI: 10.3389/fimmu.2023.1149119
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Pemphigus vulgaris associated with nasoseptal perforation, ocular conjunctival herpes infection and milia (2023)
  • 著者名/発表者名: Vernal S, Bueno-Filho R, Hashimoto T, Roselino AM
  • 雑誌名: An Bras Dermatol 巻: 98(4) ページ: 550-552
  • DOI: 10.1016/j.abd.2021.09.019
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] S2k guidelines on the management of paraneoplastic pemphigus/paraneoplastic autoimmune multiorgan syndrome initiated by the European Academy of Dermatology and Venereology (EADV) (2023)
  • 著者名/発表者名: Antiga E, Bech R, Maglie R, Genovese G, Borradori L, Bockle B, Caproni M, Caux F, Chandran NS, Corra A, D'Amore F, Daneshpazhooh M, De D, Didona D, Dmochowski M, Drenovska K, Ehrchen J, Feliciani C, Goebeler M, Groves R, Gunther C, Handa S, Hofmann SC, Horvath Hashimoto T
  • 雑誌名: J Eur Acad Dermatol Venereol 巻: 37(6) ページ: 1118-1134
  • DOI: 10.1111/jdv.18931
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Editorial: Autoimmune blistering diseases - volume II, Front Immunol, (2023)
  • 著者名/発表者名: Li X, Di Zenzo G, Schmidt E, Joly P, Hashimoto T
  • 雑誌名: Front Immunol 巻: 14 ページ: 1175962
  • DOI: 10.3389/fimmu.2023.1175962
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Usefulness of immunofluorescence overlay antigen mapping in identification of autoantigen in anti-p200 pemphigoid (2023)
  • 著者名/発表者名: Kitayama S, Makino T, Hayashi M, Mizawa M, Ishii N, Hashimoto T, Shimizu T
  • 雑誌名: J Dermatol 巻: 20 ページ: 1346-8138
  • DOI: 10.1111/1346-8138.16810
  • 査読あり
• [雑誌論文] Classification and antigen molecules of autoimmune bullous diseases (2023)
  • 著者名/発表者名: Hashimoto T, Qian H, Ishii N, Nakama T, Tateishi C, Tsuruta D, Li X
  • 雑誌名: Biomolecules 巻: 13(4) ページ: 703
  • DOI: 10.3390/biom13040703
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Analysis of anti-laminin γ1 autoantibodies in anti-p200 pemphigoid by immunoblotting using cultured cells (2023)
  • 著者名/発表者名: Hayashi D, Hashimoto T, Mine M, Ishii N, Izumi K, Tsuruta D
  • 雑誌名: Osaka City Medical Journal 巻: - ページ: -
  • 査読あり
• [雑誌論文] IgA anti-p200 pemphigoid: A rare case of bullous disease showing areolar tropism (2023)
  • 著者名/発表者名: Bujan-Bonino C, Bosch-Amate X, Hashimoto T, Ishii N, Jose M, Mascaro Jr
  • 雑誌名: Journal der Deutschen Dermatologischen Gesellschaft (JDDG) 巻: - ページ: -
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] 後天性表皮水疱症の１例 (2023)
  • 著者名/発表者名: 角田 孝彦, 吉岡 千春, 川口 純之介, 泉 健太郎,石井 文人,橋本 隆
  • 雑誌名: 山形済生館医学雑誌 巻: - ページ: -
  • 査読あり
• [雑誌論文] Case report: Mucous membrane pemphigoid with IgG and IgA anti-laminin γ1 antibodies and IgA anti-laminin α5 antibodies (2022)
  • 著者名/発表者名: Kuang W, Qian H, Zhang Q, Li W, Hashimoto T, Zeng X, Li X
  • 雑誌名: Front Immunol 巻: 13 ページ: -
  • DOI: 10.3389/fimmu.2022.903174
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Role of ADAM10 and ADAM17 in the Regulation of Keratinocyte Adhesion in Pemphigus Vulgaris (2022)
  • 著者名/発表者名: Kugelmann D, Anders M, Sigmund AM, Egu DT, Eichkorn RA, Yazdi AS, S?rdy M, Hertl M, Didona D, Hashimoto T, Waschke J
  • 雑誌名: Front Immunol 巻: 13 ページ: -
  • DOI: 10.3389/fimmu.2022.884248
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] A case of anti-BP180-type mucous membrane pemphigoid with IgG and IgA autoantibodies showing distinct reactivities (2022)
  • 著者名/発表者名: Minakawa S, Matsuzaki Y, Hashimoto T, Ishii N, Nishie W, Mitsuru N, Sawamura D
  • 雑誌名: Acta Dermatovenerol Croat 巻: 30 ページ: 54-56
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] A case of dipeptidyl peptidase-4 inhibitor-related anti-BP230-type bullous pemphigoid showing granular C3 dermatosis-like direct immunofluorescence staining (2022)
  • 著者名/発表者名: Hashimoto T, Tsunoda T, Arai Y, Izumi K, Ishii N, Qian H, Li X, Tsuruta D
  • 雑誌名: Eur J Dermatol 巻: 32 ページ: 549-551
  • DOI: 10.1684/ejd.2022.4316
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] A case of linear IgA disease with IgA antibodies to type VII collagen demonstrated by immunofluorescence overlay antigen mapping (2022)
  • 著者名/発表者名: Kitayama S, Makino T, Hayashi M,Furukawa F,Torai R,Mizawa M,Ishii N,Hashimoto T, Shimizu T
  • 雑誌名: Eur J Dermatol 巻: 32 ページ: 553-554
  • DOI: 10.1684/ejd.2022.4312
  • 査読あり
• [雑誌論文] A case of IgG and IgA anti-laminin-332 antibody-positive mucous membrane pemphigoid with IgG and IgA anti-envoplakin and anti-periplakin antibodies (2022)
  • 著者名/発表者名: Matsushima Y,Kitano M, Hayashi D,Goto H,Mine M,Yokoe T,Kondo M,Habe K, Toiyama Y, Hashimoto T, Tsuruta D, Takeuchi K and Yamanaka K
  • 雑誌名: Dermatopathology (Basel) 巻: 9 ページ: 287-291
  • DOI: 10.3390/dermatopathology9030034
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Prurigo pigmentosa clinically and immunologically mimicking autoimmune bullous disease: A case report (2022)
  • 著者名/発表者名: Kita K, Kurokawa I, Hayashi D, Hashimoto T
  • 雑誌名: Front Med (Lausanne) 巻: 9 ページ: -
  • DOI: 10.3389/fmed.2022.1047870
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Epidermolysis bullosa acquisita with concomitant autoantibodies to 3 subunit of laminin 332 (2022)
  • 著者名/発表者名: Hamaguchi M, Oiso N, Sato M, Kawada A, Tateishi C, Hashimoto T, Tsuruta D, Ohtsuka A
  • 雑誌名: J Dermatol 巻: - ページ: -
  • DOI: 10.1111/1346-8138.16677
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Associations of autoimmune bullous diseases and autoantibodies against epidermal autoantigens in patients with inflammatory myopathy (2022)
  • 著者名/発表者名: Kokubu H, Takahashi T, Tateishi C, Hashimoto T, Tsuruta D, Fujimoto N
  • 雑誌名: Mod Rheumatol 巻: - ページ: -
  • DOI: 10.1093/mr/roac159
  • 査読あり
• [雑誌論文] 【水疱症】発症初期に抗デスモグレイン1抗体がCLEIA法で陰性を示したが,2年半後の病勢軽快期に抗体価が上昇した落葉状天疱瘡の1例 (2022)
  • 著者名/発表者名: 見代 佳奈, 岩立 和子, 北島 真理子, 石井 文人, 橋本 隆, 末木 博彦
  • 雑誌名: 皮膚科の臨床 巻: 64 ページ: 9-13
  • 査読あり
• [雑誌論文] 【水疱症】免疫グロブリン大量静注療法を行った抗ラミニン332型粘膜類天疱瘡の1例 (2022)
  • 著者名/発表者名: 江口 杏子, 紺野 隆之, 逸見 愛美, 荒木 勇太, 難波 広幸, 石井 文人, 橋本 隆, 鈴木 民夫
  • 雑誌名: 皮膚科の臨床 巻: 64 ページ: 59-64
  • 査読あり
• [雑誌論文] 【水疱症】後天性表皮水疱症の急性増悪に対し,ステロイドパルスと免疫グロブリン大量静注療法が有効だった1例 (2022)
  • 著者名/発表者名: 阿部 佳奈美, 川瀬 正昭, 山田 朋子, 石井 文人, 橋本 隆, 出光 俊郎
  • 雑誌名: 皮膚科の臨床 巻: 64 ページ: 73-77
  • 査読あり
• [雑誌論文] 天疱瘡・類天疱瘡患者の日常生活における困難感 (2022)
  • 著者名/発表者名: 種村 智香, 布谷 麻耶, 師岡 友紀, 川端 京子, 鶴田 大輔, 橋本 隆
  • 雑誌名: 日本看護学会雑誌 巻: 42 ページ: 365-374
  • 査読あり
• [雑誌論文] 尋常性乾癬の紫外線治療後に生じた表皮下水疱症の１例 (2022)
  • 著者名/発表者名: 稲沖 真, 西島 千博, 中村 裕美, 石井 文人, 橋本 隆
  • 雑誌名: 皮膚臨床 巻: 64 ページ: 1519-1522
  • 査読あり
• [雑誌論文] ELISA法にて全長BP180陽性、免疫ブロット法にてBP230陽性となったDPP-4阻害薬関連類天疱瘡の1例 (2022)
  • 著者名/発表者名: 清水 千尋, 立石 千晴, 今西 明子, 白鳥 隆宏, 前川 直輝, 鶴田 大輔, 橋本 隆, 泉 健太郎, 深井 和吉
  • 雑誌名: 皮膚の科学 巻: 21 ページ: 34-38
  • 査読あり
• [雑誌論文] 抗ラミニンγ1類天疱瘡と抗ラミニン332型粘膜類天疱瘡を合併した1例 (2022)
  • 著者名/発表者名: 岩津 理世, 佐藤 雅子, 加藤 麻衣子, 柳原 茂人, 大磯 直毅, 立石 千晴, 橋本 隆, 鶴田 大輔, 川田 暁, 大塚 篤司
  • 雑誌名: 皮膚の科学 巻: 21 ページ: 126-132
  • 査読あり
• [雑誌論文] バルヒディオ配合錠による薬剤誘発性類天疱瘡の１例 (2022)
  • 著者名/発表者名: 角田 孝彦，新井 陽介，川口 純之介，小関 伸，泉 健太郎，石井 文人，橋本 隆
  • 雑誌名: 山形済生館医誌 巻: 47 ページ: 58-62
  • 査読あり
• [学会発表] 超高齢者に発症した抗ラミニン332型および抗BP180型合併粘膜類天疱瘡(MMP)の1例 (2022)
  • 著者名/発表者名: 来田 英伸, 菊澤 千秋, 文 省太, 出野 りか子, 池田 彩, 小澤 健太郎, 橋本 隆
  • 学会等名: 第490回日本皮膚科学会大阪地方会(Web開催)
• [学会発表] 抗ラミニンα3抗体を同定し抗ラミニン332型粘膜類天疱瘡と診断した1例 (2022)
  • 著者名/発表者名: 福満 祥子, 福本 毅, 川上 大輔, 南 祐介, 谷川 絢乃, 久保 亮治, 長井 隆行, 入谷 啓介, 橋本 隆, 平子 善章
  • 学会等名: 第490回日本皮膚科学会大阪地方会(Web開催)
• [学会発表] BP230抗体が単独陽性であったトラゼンタによると思われる水疱性類天疱瘡 (2022)
  • 著者名/発表者名: 角田 孝彦, 川口 純之介, 大原 香子, 泉 健太郎, 石井 文人, 橋本 隆
  • 学会等名: 第397回日本皮膚科学会福島地方会例会. 福島
• [学会発表] 抗デスモグレイン1抗体の上昇が認められ臨床的に腫瘍随伴性天疱瘡が疑われた1例, (2022)
  • 著者名/発表者名: 井上 舞, 川村 飛翔, 佐川 展子, 蒲原 毅, 石井 文人, 橋本 隆
  • 学会等名: 第902回日本皮膚科学会東京地方会(合同臨床地方会)(Web開催)
• [学会発表] 後天性表皮水疱症の1例 (2022)
  • 著者名/発表者名: 井上 舞, 川村 飛翔, 佐川 展子, 蒲原 毅, 石井 文人, 橋本 隆
  • 学会等名: 第400回日本皮膚科学会宮城地方会学術大会例会
• [図書] McGraw Hill Education (2022)
  • 著者名/発表者名: Hashimoto T
  • 総ページ数: -
  • 出版者: Chapter 62, Intercellular IgA dermatosis/IgA pemphigus”, 10th edition of Fitzpatrick's Ddermataology, edited by Kang S, Amagai M, Bruckner AL, Enk AH, Marglis DJ, McMichael AJ, Orringer JS