| 研究課題/領域番号 |
21K08358
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| 研究機関 | 帝京大学 |
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研究代表者 |
日下部 吉男 帝京大学, 薬学部, 講師 (30338537)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | アレルギー / DIHS / HLA / 立体構造 / インシリコ |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、HLA-B*13:01を持つ人がDIHSを引き起こす薬物を服用してもアレルギー反応を起こさないペプチド様医薬品開発の指針を得ることである。そこで本研究ではまず、HLA-B*13:01単独構造およびHLA-B*13:01-アロプリノール複合体、フェノバルビタール複合体の立体構造をX線結晶構造解析の手法を用いて明らかにすることを目指している。本年度は、HLA-B*13:01単独構造の構造解析を目指した。多くのHLAはβ2-Microglobulinとの複合体での立体構造解析が行われているため、本研究に関しても立体構造を明らかにするために、大量のHLA-B*13:01およびβ2-Microglobulinが必要である。そこで、HLA-B*13:01およびβ2-Microglobulinの大量発現の最適化条件の検討を行った。
HLA-B*13:01に関しては大量培養後、尿素で可溶化し、TALONカラムを用いた金属アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーの2種類のクロマトグラフィーを行うことでSDS-PAGE上、単一バンドのHLA-B*13:01を得ることに成功した。また、β2-Microglobulinも大量に必要なため、HLA-B*13:01だけではなく、β2-Microglobulinに関してもpCold-ProS2タグを用いた大腸菌発現系を構築した。大量培養後、TALONカラムを用いた金属アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーの2種類のクロマトグラフィーを行うことでSDS-PAGE上、単一バンドのβ2-Microglobulinを得ることに成功している
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
HLA-B*13:01およびβ2-Microglobulinの大量精製を行っている。両タンパクともに尿素を用いた可溶化が必要である。両タンパクともに尿素で可溶化後、PBSでの透析を行った際に、多くのタンパク質が不溶性画分に行ってしまうために、大量に精製することが出来なかった。今後は、発現する大腸菌の種類を変更するなど、さらなる条件検討が必要となる。
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| 今後の研究の推進方策 |
HLA-B*13:01の構造解析を目指しており、構造解析を行うためには、大量のHLA-B*13:01およびβ2-Microglobulinが必要である。そこで、両タンパクを大量に精製するために、最適な発現条件、精製条件等、さらなる条件検討が必要となるため、本年度中に最適な発現条件、精製条件を確立したい。大量精製に成功したのち、結晶化が難しいとされるX線結晶構造解析だけでなく、cryo電子顕微鏡を用いた構造解析を試みたい。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度は、最適な条件検討を行うことに重みを置いたため、予算が多く必要なタンパク質の結晶化および構造解析を行うことが出来なかった。そこで、来年度に結晶化および構造解析を重点的に行うために、予算の繰り越しを行った。
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