| 研究課題/領域番号 |
21K08368
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| 研究機関 | 信州大学 |
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研究代表者 |
松田 和之 信州大学, 学術研究院保健学系, 教授 (00647084)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | JMML / ゲノム編集 / iPS細胞 / メチル化解析 / PTPN11変異 |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、PTPN11変異によるメチル化調節機構の解明することである。これまでにPTPN11変異の有無のみ異なるJMML由来iPS細胞を樹立し、各iPS細胞について変異を修復したiPS細胞および変異を修復したiPS細胞も作製している。直接的にPTPN11変異によるメチル化への影響・機構を解析できる最適な研究試料を使用して研究が遂行できる。網羅的メチル化解析（ビーズアレイ）の委託解析を計画していたため、高濃度のゲノムDNAが必要であるため各iPS細胞からのCD34陽性細胞の分化誘導について培養条件やサイトカイン添加条件を検討してきた。2022年度末に網羅的メチル化解析（ビーズアレイ）の委託が可能となった。
2022年度の研究成果は、iPS細胞からCD34陽性細胞を分化する際の4種類のサイトカイン濃度を各2倍量に増加し、さらに、回収時のピペットでの剥離と分散操作を繰り返すなどの操作上の細かい点まで調整することにより回収細胞数を増加させることができ、高濃度のゲノムDNAを回収できるようになった。本疾患関連の遺伝子について、Bisulfite処理・シークエンス解析による予備的なメチル化解析を行い、学会発表を行った（第69回日本臨床検査医学会学術集会、栃木県）。そして、2022年度末に網羅的メチル化解析（ビーズアレイ）をタカラバイオ株式会社への委託することができた。2023年度早期に解析が終了し、データ納品される（2022年度の残助成金と2023年度の助成金を合わせて支払いを行う予定である）。2023年度には、CpGアイランド、遺伝子、およびプローブ別のメチル化率の違いについて比較解析を行う予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
網羅的メチル化解析（ビーズアレイ）に適した高濃度ゲノムDNAの回収が難しく、サイトカイン添加順序や濃度の検討を繰り返し実施していたため研究全体の進捗について「やや遅れいている」と判断した。検討の結果、同時添加かつ濃度を2倍量とすることで、より高濃度のゲノムDNAを回収することができるようになった。網羅的メチル化解析（ビーズアレイ）について、2022年度末に委託することができた。網羅的メチル化解析（ビーズアレイ）の結果は、2023年度当初には納品予定のため、事項の研究推進方策に従い、実験を進めていきたい。
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| 今後の研究の推進方策 |
委託解析を依頼している網羅的メチル化解析（ビーズアレイ）の結果に基づいて、PTPN11変異陽性iPS細胞とその遺伝子変異を修復改変したiPS細胞、PTPN11変異陰性iPS細胞とそれに変異を導入したiPS細胞の4種類より分化誘導したCD34陽性細胞のプローブ毎、遺伝子毎、CpGアイランド毎のメチル化率を比較解析する。変異陽性細胞と変異を修復した細胞、変異陰性細胞と変異を導入した細胞でのメチル化率の違いは、直接的にPTPN11変異の有無による違いを反映できるため、特に注目して比較値を解析する。
メチル化率に違いが認められた遺伝子について、Bisulfite処理・シークエンス解析法を行い個別にメチル化率を求めて解析する。さらに、当該遺伝子について発現表変化への影響をリアルタイムPCR法を用いて解析し、目的を達成するため研究を遂行する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
PTPN11変異陽性iPS細胞とその遺伝子変異を修復改変したiPS細胞、PTPN11変異陰性iPS細胞とそれに変異を導入したiPS細胞の4種類より分化誘導したCD34陽性細胞について、網羅的メチル化解析（ビーズアレイ）による解析値を得るためには、最低2回測定が必要であったため、2022年度はサイトカインや培養液など培養関連試薬の購入を行いながら、サイトカイン添加順序や濃度の検討を繰り返し実施し、最適な添加方法と濃度を決定できた。しかし、予定していた委託解析の網羅的メチル化解析（ビーズアレイ）見積額は2022年度の残りの助成金額を超えていたため、2023年度助成金と併せて支払いをすることとした。なお、解析依頼自体は、2022年度末に依頼することができた。
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