| 研究課題/領域番号 |
21K08414
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
蝶名林 和久 京都大学, 医学研究科, 特定病院助教 (00646010)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 非定型3q26転座型骨髄性腫瘍 / EVI1活性化 / スーパーエンハンサー / 疾患特異的iPS細胞 / BET阻害剤 |
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| 研究実績の概要 |
当初の研究計画に沿って、令和３年度に下記の進捗があった。
１）次世代シークエンサーを用いた非定型EVI1遺伝子再構成MDS症例のゲノム解析：MDS-iPS細胞が樹立できた非定型EVI1転座陽性MDS症例の骨髄検体のターゲットシークエンスを行い、ASXL1、PTPN11、ETNK1、SETD2などMDSで高頻度に認められる変異を同定した。
２）MDS-iPS細胞を用いた病態再現：１）の症例から樹立したMDS-iPS細胞株のEVI1転座の切断点は、いずれも患者骨髄検体と同一であることをサンガーシークエンスにて確認した。複数のMDS-iPS細胞株を胚様体形成法による分化誘導系を用いてin vitroで造血誘導し、造血前駆細胞分画（CD45+CD34+）でソートして、GM-CSF、G-CSF、IL3、IL-6、SCF、EPO 存在下でコロニーアッセイを行ったところ、コロニー形成能及び赤血球系分化能が著明に障害されていた。また造血前駆細胞から成熟血球誘導を行い、フローサイトメトリーによりCD235a陽性率の測定及びギムザ染色による形態学的評価を行ったところ、赤血球系への著明な分化障害を認めた。同一症例由来の複数のMDS-iPS細胞株を用いて、１）のターゲットシークエンスから得られた遺伝子変異の有無について検討したところ、iPS細胞株によって共存変異のパターンが異なっており、元の症例のクローン多様性を反映していると考えられた。
３）MDS-iPS細胞の網羅的エンハンサー解析：MDS-iPS細胞株及び再分化させた造血前駆細胞のゲノムDNAを材料に、H3K27acのChIP-seqにより網羅的なエンハンサー解析を行い、造血前駆細胞特異的に活性化しているスーパーエンハンサーを同定した。
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| 現在までの達成度 |
現在までの達成度
2: おおむね順調に進展している
理由
令和３年度は、上記のように１）次世代シークエンサーを用いた非定型EVI1遺伝子再構成MDS症例のゲノム解析、２）MDS-iPS細胞を用いた病態再現、３）MDS-iPS細胞の網羅的エンハンサー解析を計画していた。１）、２）、３）についてほぼ達成できた。
以上のように、当初検討していた実験計画に関しておおむね順調に進展していると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
上記１）、２）、３）の課題を引き続いて行う。
４）スーパーエンハンサーを標的としたEVI1発現抑制（令和4年度、5年度）：MDS-iPS細胞を用いて、３）で同定された転写制御領域を標的として部位特異的にエピゲノム制御が可能なやCRISPR-knockoutやCRISPRi (CRISPR interference) を行い、EVI1発現の低下を確認する。さらに２）の病態再現系を用いて、EVI1発現抑制に伴い増殖及び分化異常の表現型が改善するかどうか検討する。増殖能の評価はMTSアッセイやAnnexin Vアッセイにて行い、分化能の評価は２）と同様にコロニーアッセイ、フローサイトメトリーによる細胞表面抗原マーカー解析やギムザ染色による形態学的手法などで評価する。さらにMDS-iPS細胞を用いて、利用可能なBET阻害剤などによるEVI1発現抑制効果を確認する。
５）マウスモデルによる薬効評価（令和5年度）：２）の免疫不全マウスによる病態再現系を用いて、４）で選定されたBET阻害剤などのin vivoでの薬効評価を確認する。この際、同一症例由来の複数のiPS細胞株で構築したヒト化白血病マウスモデルを用いることで、各iPS細胞株の由来サブクローンの造腫瘍性を個別に検討し、薬剤感受性の差異についても検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
理由：令和３年度は、次世代シークエンサーを用いた非定型EVI1遺伝子再構成MDS症例のゲノム解析、MDS-iPS細胞を用いた病態再現、MDS-iPS細胞の網羅的エンハンサー解析を行った。病態再現においてMDSの顕著な表現型がみられたため、当初の予定よりも少ない株数においてゲノム解析・病態再現・網羅的エンハンサー解析を行うことが可能であったため、細胞培養・分化誘導やシークエンス解析等のコストが当初予定より少なくなり、未使用額が生じた。
使用計画：上記理由のため、次年度は、予定より解析対象細胞株数を増やして、MDS-iPS細胞の網羅的遺伝子発現解析、スーパーエンハンサーを標的としたCRISPRやBET阻害剤によるEVI1発現抑制の実験を行う予定であり、未使用額はその経費に充てることとしたい。
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