T細胞依存性遅発型喘息反応メディエータの解明

2021 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 21K08486
• 研究機関: 独立行政法人国立病院機構(相模原病院臨床研究センター)
• 研究代表者: 森 晶夫 独立行政法人国立病院機構(相模原病院臨床研究センター), 先端技術開発研究部, 部長 (80251247)
• 研究分担者: 神山 智 独立行政法人国立病院機構(相模原病院臨床研究センター), 先端技術開発研究部, 研究員 (20626783) [辞退] ; 神沼 修 広島大学, 原爆放射線医科学研究所, 教授 (80342921) ; 大友 隆之 東京薬科大学, 薬学部, 講師 (90463108)
• 研究期間 (年度): 2021-04-01 – 2024-03-31
• キーワード: 気管支喘息 / T細胞 / 遅発型喘息反応 / メディエータ

研究実績の概要

ダニ粗抗原に応答してT細胞IL-5産生が誘導され、吸入負荷で遅発型喘息反応が認められる症例の末梢血単核球を、当該抗原で刺激し、限界希釈法により、T細胞クローンを樹立した。卵白アルブミン（OVA）特異的T細胞受容体トランスジェニックマウスより、T細胞クローンを複数樹立した。これらのT細胞クローンを固相化抗CD3抗体で活性化し、上清中のサイトカイン産生を特異的ELISAで測定した。培養ヒトあるいはマウス気管支平滑筋細胞を、24 well plate内でコラーゲンゲルに封入し、6日間培養後に収縮活性のアッセイに用いた（Kitamura N, et al. Int. Arch. Allergy Immunol. 146:36, 2008, Kitamura N, et al. Int. Arch. Allergy Immunol. 149:83, 2009, Kouyama S, et al. Int. Arch. Allergy Immunol. 161 (Suppl 1):93, 2013）。マウスでは各々のT細胞クローンを無処置マウスに移入し、抗原チャレンジ後、無拘束呼吸機能解析装置（BUXCO）を用いてPenh（enhanced pause）値を、また麻酔下、レスピレータ装着下に呼吸機能測定装置（BUXCO社）を用いて、呼吸抵抗（RL）値を測定した。実験喘息モデルでの抗原特異的遅発型喘息反応（in vivo）と、in vitroでのT細胞クローン培養上清中の気管支平滑筋収縮活性の関連について解析した。活性化に伴い気管支平滑筋収縮活性を産生するT細胞クローンを複数樹立できたので、上清を大量に作成し、濃縮、保存した。収縮活性の精製を目指し、ゲル濾過、イオン交換により分画し、平滑筋収縮活性を評価した。平滑筋収縮活性の高いクローンと平滑筋収縮活性のないクローンとの間で、遺伝子発現解析を比較した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

2021年度に予定していた3項目のうち、①IgE非依存性、T細胞依存性の遅発型喘息反応のcharacterization、新規気管支平滑筋収縮物質の同定　―　非アトピー型喘息症例末梢血Tリンパ球、T細胞クローンの培養、培養ヒト気管支平滑筋細胞のゲル内収縮実験、②生化学的精製、ジーンチップ解析、③T細胞依存性マウス気管支閉塞モデルの解析、が概ね順調に進行し、次年度の進展につながる成果が得られた。

今後の研究の推進方策

2021年度に開始した研究項目のうち、②、③を継続する。加えて、当初予定していた研究項目の、④平滑筋収縮候補分子の発現、アッセイ（中和含む）、モノクローナル抗体作成、に取り組む。②、③の結果絞り込まれた候補分子について、リコンビナント体を作成し、臨床検査診断薬開発に向けたモノクローナル抗体作成を開始したい。

次年度使用額が生じた理由

研究計画当初予定していた研究項目の②生化学的精製、ジーンチップ、プロテオーム解析において、プロテオーム解析の実験条件についての詳細な検討を進めている段階で、実際に本実験を実施する際に必要となる試薬については、次年度に購入するため、約26万円使用しなかった。

研究成果

• [雑誌論文] Suppressive effect of dexamethasone on murine Th9 cell-mediated nasal eosinophilic inflammation (2021)
  • 著者名/発表者名: Koyama, T., Miura, K., Yamasaki, N., Ogata, S., Saeki, M., Hiroi, T., Mori, A., and Kaminuma, O.
  • 雑誌名: Asia Pac Allergy 巻: 11 ページ: e25
  • DOI: 10.5415/apallergy.2021.11.e25
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] L-type amino acid transporter 1 inhibitor suppresses murine Th2 cell-mediated bronchial hyperresponsiveness independently of eosinophil accumulation (2021)
  • 著者名/発表者名: Ito, D., Miura, K., Saeki, M., Yamasaki, N., Ogata, S., Mori, A., Endou, H., Hayashi, K., and Kaminuma, O.
  • 雑誌名: Asia Pac Allergy 巻: 11 ページ: e33
  • DOI: 10.5415/apallergy.2021.11.e33
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Pharmacological characterization of T cell-induced bronchoconstriction in vivo and in vitro (2021)
  • 著者名/発表者名: Mori, A., Kouyama, S., Yamaguchi, Y., Kumitani, C., Ohtomo-Abe, A., Kawasaki, Y., Iwamoto, K., Yano, K., Iwata, M., Nagayama, K., Ryu, K., Nakamura, Y., Hamada, Y., Watai, K., Kamide, Y., Sekiya, K., Fukutomi, Y., Ohtomo, T., and Kaminuma, O.
  • 学会等名: European Academy of Allergy and Clinical Immunology Hybrid Congress 2021 (Madrid-Krakow, on line)
  • 国際学会
• [学会発表] Sublingual immunotherapy suppresses mast cell degranulation through the upregulation of thrombospondin-1 (2021)
  • 著者名/発表者名: Kaminuma, O., Kitamura, N., Gotoh, M., Okubo, K., Mori, A., and Hiroi, T.
  • 学会等名: European Academy of Allergy and Clinical Immunology Hybrid Congress 2021 (Madrid-Krakow, on line)
  • 国際学会
• [学会発表] Molecular characterization of bronchoconstriction induced by activated T cells (2021)
  • 著者名/発表者名: Kouyama, S., Yamaguchi, M., Kumitani, C., Ohtomo-Abe, A., Kawasaki, Y., Iwamoto, K., Yano, K., Iwata, M., Nagayama, K., Ryu, K., Nakamura, Y., Hamada, Y., Watai, K., Kamide, Y., Sekiya, K., Fukutomi, Ohtomo, T., Kaminuma, O, and Mori, A.
  • 学会等名: European Respiratory Society 2021 International Congress (London, on line)
  • 国際学会
• [学会発表] Possible mechanisms of T cell-induced bronchoconstriction (2021)
  • 著者名/発表者名: Mori, A., Kouyama, S., Ohtomo-Abe, A., Ryu, K., Nakamura, Y., Hamada, Y., Watai, K., Kamide, Y., Sekiya, K., Ohtomo, T., Kaminuma, O.
  • 学会等名: Asia Pacific Association of Allergy, Asthma and Clinical Immunology International Conference 2021 (Taipei, on line)
  • 国際学会
• [学会発表] T細胞依存的に発症する新しいアレルギー性皮膚炎モデル (2021)
  • 著者名/発表者名: 尾形佐和子、三浦健人、吉川日出夫、森 晶夫、廣井隆親、神沼 修
  • 学会等名: 第70回日本アレルギー学会学術大会（横浜）
• [学会発表] アレルゲン特異的IgE測定用3次元マイクロアレイの開発1（第2報）：食物アレルゲン特異的IgE抗体測定性能評価 (2021)
  • 著者名/発表者名: 若山 翔、中川 舞、川上和美、古志洋一郎、伊藤正照、森 晶夫
  • 学会等名: 第70回日本アレルギー学会学術大会（横浜）
• [学会発表] アレルゲン特異的IgE測定用3次元マイクロアレイの開発2（第2報）：吸入アレルゲン特異的IgE抗体測定性能評価 (2021)
  • 著者名/発表者名: 川上和美、中川 舞、若山 翔、古志洋一郎、伊藤正照、森 晶夫
  • 学会等名: 第70回日本アレルギー学会学術大会（横浜）
• [学会発表] Th9細胞依存的なアレルギー性炎症は標的臓器間で異なるステロイド応答性を示す (2021)
  • 著者名/発表者名: 三浦健人、佐伯真弓、古山禎大、山崎憲政、尾形佐和子、廣井隆親、森 晶夫、神沼 修
  • 学会等名: 第70回日本アレルギー学会学術大会（横浜）
• [学会発表] Th17細胞依存的ステロイド抵抗性喘息モデルに対するアミノ酸トランスポーターLAT1阻害薬の効果 (2021)
  • 著者名/発表者名: 林啓太朗、佐伯真弓、三浦健人、山崎憲政、尾形佐和子、森 晶夫、廣井隆親、遠藤 仁、神沼 修
  • 学会等名: アレルギー・好酸球研究会2021
• [学会発表] Th17細胞依存的マウス鼻粘膜炎症モデルに対するdexamethasoneの効果 (2021)
  • 著者名/発表者名: 三浦健人、上田周作、山崎憲政、尾形佐和子、川崎英利、森 晶夫、神沼 修
  • 学会等名: アレルギー・好酸球研究会2021
• [学会発表] 微量検体から多項目のアレルゲン特異的IgEを測定する3次元マイクロアレイの評価1 (2021)
  • 著者名/発表者名: 古志洋一郎、中川 舞、川上和美、伊藤正照、森 晶夫
  • 学会等名: 第58回日本小児アレルギー学会（横浜/Web開催）
• [学会発表] 微量検体から多項目のアレルゲン特異的IgEを測定する3次元マイクロアレイの評価2 (2021)
  • 著者名/発表者名: 川上和美、中川 舞、古志洋一郎、伊藤正照、森 晶夫
  • 学会等名: 第58回日本小児アレルギー学会（横浜/Web開催）