| 研究課題/領域番号 |
21K08503
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| 研究機関 | 富山県衛生研究所 |
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研究代表者 |
大石 和徳 富山県衛生研究所, その他部局等, 所長 (80160414)
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| 研究分担者 |
金谷 潤一 富山県衛生研究所, 細菌部, 主任研究員 (80463131)
磯部 順子 富山県衛生研究所, 細菌部, 上席専門員 (10421893)
安居 輝人 国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所, 医薬基盤研究所 感染症制御プロジェクト, プロジェクトリーダー (60283074)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 肺炎球菌 / 血清型 / 莢膜 / 脳微小血管内皮細胞 / 髄膜炎 / 経細胞間移動 / 経細胞侵入 |
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| 研究実績の概要 |
1．脳微小血管内皮細胞(TY09細胞)の細胞培養系における細胞間移動(bacterial transcytosis; BT)と細胞侵入(Bacterial invasion: BI)の評価：髄膜炎発症のリスクが高い血清型10A、23と髄膜炎リスクが低い血清型19Aを用いてin vitroでTY09細胞を用いてBTおよびBIを測定した。この結果、TY09細胞における血清型10A,23A, 19AのBTは0.2から0.5%と血清型によるBT(%)の差は無かった。また、同様にY09細胞における血清型10A,23A, 19AのBIを測定したところ、BT(%)とBI(%)は正相関を示し、BT(%)はBI(%)の約100倍であった。これらの所見からBTの大部分はparacellular routeによっていることが示唆された。このため、TY09細胞におけるBTにおけるバリア機能評価の目的で電気抵抗値の測定を進めた。血清型10A, 23Aの肺炎球菌株の添加から2時間後に電気抵抗値(TEERΩcm2)は10（0時間）から6-8（2時間）に低下し。BTの課程で2時間の菌インキュベーションで電気抵抗値が20-40％低下することが判明した。
2．莢膜遺伝子欠損のBTおよびBIに及ぼす影響：血清型3の親株(WU2)と莢膜遺伝子欠損株では、BTには影響しなかった。また、親株ではBIは検出できなかったのに対し、cps欠損株ではBIは0.2％と有意に高まった。この結果から、莢膜発現はBIを阻害することが判明した。
3．RNA seq（トランスクリプトーム）解析：ヒト血管内皮細胞(HUEhT-2)細胞に血清型23A,3の菌株を添加し2時間後のRNAseqの解析を行ったところ、菌存在下でup-regulationされたpathwayが多数検出され、菌添加時のヒト上皮細胞側のRNAseq解析ができることを確認した。血清型間で質的に宿主相互作用が異なることが明らかとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
令和4年度は、in vitro細胞培養系でトランズウェルの上層から下層への色素漏れのないTY09細胞を用いてBTおよびBIの実験を進めた。血清型として髄膜炎発症の高リスクとされる10A,23A,髄膜炎低リスクとされる19Aを評価したが、リスクの高低ではBT％に差が認められなかった。一方では、複数の血清型、菌株を用いた検討から、BT(%)とBI(%)は正相関を示し、BT(%)はBI(%)の約100倍であった。この所見からBTの課程にBIの関与は少ないと考えられることから、BTはparacellular routeで起こっていると推定された。また、莢膜遺伝子欠損株を用いた実験から、莢膜発現はBTには関係しないが、BIは抑制されることが判明した。このように、令和4年度はTY09細胞を用いたin vitro細胞培養系における肺炎球菌による粘膜バリアの通過および侵入過程への理解を深めることに、時間を要した。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和5年度中にTY09細胞を用いて、肺炎球菌のBlood-brain-CSF barrier通過メカニズムの一端を明らかにする。
1．試験菌株数が限られているため、リスクの高低とBT%の関係性を明らかにするには、より多くの血清型、菌株数を用いたBTの評価が必要と考える。
2．BTとBIとの関連性からparacellular routeを介したＢＴの評価が必要となった。このため、共焦点顕微鏡と抗肺炎球菌単抗体を用いて肺炎球菌が培養細胞をpericellular routeで通過(BT)することを明らかにする。
3．異なる血清型の肺炎球菌をTY09の細胞培養にインキュベートし、ヒト細胞側のRNAseq解析を実施し、血清型間での宿主相互応答の違いを明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
R3年度、R4年度には、医薬基盤研の安居輝人（研究分担者）によるトランスクリプトーム解析、プロテオーム解析に供するヒト上皮細胞を決め切れなかったために、本格的な解析を実施するに至らなかった。このため、研究経費800,000円が未使用となった。R5年度にTY09細胞を用いてトランスクリプトーム解析、プロテオーム解析を実施し、研究目的を達成する見込みである。
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