| 研究課題/領域番号 |
21K08606
|
|---|
| 研究機関 | 日本大学 |
|---|
研究代表者 |
細川 崇 日本大学, 医学部, 助手 (50870094)
|
|---|
| 研究分担者 |
松本 太郎 日本大学, 医学部, 教授 (50366580)
金田 英秀 日本大学, 医学部, 助教 (30598967)
上原 秀一郎 日本大学, 医学部, 准教授 (00448060)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
|
| キーワード | 肛門括約筋 / 脱分化脂肪細胞 / exosome / 筋再生治療 |
|---|
| 研究実績の概要 |
本年度は、前年度に引き続き、DFAT由来のexosomeが筋芽細胞分化誘導に与える影響について検討を行った。マウス筋芽細胞株であるC2C12細胞を培養した。C2C12細胞をdishに播種した後、DMEM（control）群、DFAT由来exosomeを添加したDMEM群、DFAT condition medium群、exosome を除去したDFAT condition medium群の4群に分けて、継続培養を行った。培養、分化誘導したC2C12細胞を4％パラホルマリンで固定した後、一次抗体として抗マウスミオシン重鎖抗体（抗マウスF59 抗体）を、2次抗体としてAlexa-Fluor-568-conjugated ヤギ 抗マウス IgG 抗体を用いて免疫組織化学染色を行った。当初、4日間の継続培養期間で検討を行っていたが、その有効性を評価するために、至適培養期間、細胞源であるDFATの継代数による検討を加えた。その結果、exosome添加DMEM群、DFAT condition medium群において、control群、exosome除去DMEM群に比べ、Nuclei number、Fusion indexはともに高い傾向がみられたが、検討項目による大きな差異を現時点で認めるには至らなかった。
また、ラットの肛門括約筋障害モデルに対する検討に関して、8週齢のSprague-Dawley（SD）ラットに対し、肛門内腔側と肛門周囲の、3時、6時、9時、12時方向20μM Cardiotoxin (CTX)を100μlで局所投与する事でモデルを作製し、肛門内圧を定点測定することで、モデルの評価を行った。当初、安定したモデルの作製ができず、CTX濃度、投与量の再検討と行うに至った。その結果、500μlずつ投与する事で、安定した肛門括約筋障害を誘発する事が出来た。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
DFAT由来のexosomeが筋芽細胞分化誘導に与える影響について検討に関して、継続培養期間を4日から7日まで日数による検討を行った。また、マウスDFATの継代数によって差異があるかについても検討を行った。しかし、群間で比較をした際にexosome添加DMEM群、DFAT condition medium群は、control群、exosome除去DMEM群に比べ、分化誘導が進んでいる傾向が見られたものの、条件の検討によって有意差が出るには至らなかった。また、ラットの肛門括約筋障害モデルに対する検討においては、安定したモデルの作製に難渋し、CTXの濃度、投与量による検討を行うことで、Cardiotoxin(CTX)の濃度は変更せず、 投与量を500ulへ変更したところ、既存の報告に類似した肛門括約筋障害を安定して誘発するこができた。さらに、ラットから脂肪組織を採取し、DFATを作製することで、ラットの肛門括約筋障害モデルに対するDFAT、DFAT由来exosomeの投与実験の準備を行った。今回、in vitroにおいて、マウスDFATを多く使用したが、実験途中で細胞の調整に難渋したため、実験の進行に遅滞が生じてしまった。また、安定した肛門括約筋障害モデルラットの作製に時間を有したため、進捗状況としてはやや遅れていると判断した。
|
| 今後の研究の推進方策 |
今後の方針としてはDFAT exosomeを用いた分化誘導実験では、引き続きDMEMにマウスDFAT由来のexosomeを添加した培地を用いてC2C12の分化誘導を行いMyoD及びMyoGの発現が増加する事を確認する。DFAT condition mediumからexosomeを除去した培地を作製し、C2C12の培養に使用し、MyoD及びMyoGの発現に影響を与えるかを評価する。また、ラットの肛門括約筋障害モデルに対するDFAT由来のexosome投与実験においては、ラット由来DFATからexosomeを抽出し、肛門括約筋障害モデルラットに対して、exosomeを局所投与し、肛門の機能評価を行い、括約筋の修復にどのような影響を与えるかを検討する予定である。さらには、DFATを骨格筋細胞へ分化誘導した後に採取したexosomeが、通常のDFAT由来exosomeに比べ、より筋再生を促進させるかについても検討を行う予定である。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
DFAT由来のexosomeが筋芽細胞分化誘導に与える影響の検討に関して、途中で細胞源であるマウスDFATの調整に難渋した。そのため、当初の研究計画より遅れが生じ、当該年度の支出額が予定額を下回った。次年度はより多くの分化誘導実験を行う予定である。また、安定したラットモデルの作製には、当初予定していた量を上回るCTXが必要となったため、前年度で使用できなかった差額は遅滞の生じた筋分化誘導実験と、CTXの追加購入に使用する予定である。
|
