| 研究課題/領域番号 |
21K08633
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| 研究機関 | 大阪医科薬科大学 |
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研究代表者 |
柴田 雅朗 大阪医科薬科大学, 医学部, 功労教授 (10319543)
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| 研究分担者 |
伊藤 裕子 大阪医科薬科大学, その他部局等, 功労教授 (40148432)
谷口 高平 大阪医科薬科大学, 医学部, 講師 (70779686)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | nSM2 / Smpd3 / エクソソーム / ノックアウト / ノックダウン / 乳癌 / 転移 / マウス |
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| 研究実績の概要 |
＜背景と目的＞ 癌転移の成立には癌細胞の生着に適した転移先臓器での微小環境（前転移ニッチ）の形成が必要である。癌細胞の分泌するエクソソームには前転移ニッチを形成する能力があることや転移先臓器を規定するといった報告がある。また、癌の進展に対して促進的に作用しているとも報告されている。転移は癌による死因の殆どを占めていることから、エクソソーム分泌に関わる遺伝子を標的とする治療戦略を試みる。エクソソーム分泌に関わる遺伝子として、Neutral sphingomyelinase 2 (nSM2)、Rab27aおよびAlixの３遺伝子が知られている。そのうち、nSM2はエクソソーム形成の初期段階に関与し、他の経路と非依存的に進行することから、nSM2遺伝子（またはSphingomyelin phosphodiesterase 3、Smpd3と称される）を転移性のマウス乳癌細胞において、欠失あるいはノックダウンさせる。
＜方法＞ マウスnSM2遺伝子のノックアウトベクターの作製と乳癌細胞株への遺伝子導入を株式会社セツロテックに依頼した。３種類のガイド配列を用いた乳癌細胞の中からノックアウト細胞のSingle cell cloneを順次、作製しているが、結果は芳しくなく、現時点でノックアウト細胞株を樹立していない。現在も実験中である。ノックアウトが上手くいかない場合を想定して、siRNAによるノックダウン戦略も実行してゆく。nSM2に対する有効なsiRNA配列を決定し、GFPの組み込まれたnSM2-shRNA発現ベクターを作製した。このnSM2-shRNA発現ベクターを用いて当該遺伝子をノックダウンさせる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
目的遺伝子が欠失した細胞をZsGreen1による緑色蛍光とG418によりセレクションし、引き続き限界希釈により、細胞をクローン化し、ノックアウト細胞を探しているが、予想以上に難航している。ノックアウトが出来ない場合を想定して、shRNA発現ベクターを乳癌細胞に組み込んで当該遺伝子をノックダウンさせ、転移抑制の評価をする。マーカー遺伝子GFPを組み込んだshRNA発現ベクターは既に作製済みである。
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| 今後の研究の推進方策 |
nSM2遺伝子をノックアウトした乳癌細胞あるいは当該遺伝子をノックダウンした乳癌細胞をマウスに移植し、対照群と比較して、全身諸臓器について病理組織学的に転移の有無を精査し、転移抑制に繋がるかどうかを評価し、転移抑制の治療ツールになり得るか否かを解析する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
目的遺伝子のノックアウト細胞が含まれている可能性のある細胞をバルクの状態（３種類）で受託会社から入手し、当方でノックアウト細胞の選別を抗生物質G418とマーカー遺伝子により行っているが、選択した細胞はノックアウトされておらず、実験は難航している。バルクを変えて、確認作業を行っている。次年度は、引き続きノックアウト細胞作製と別手法により当該遺伝子をノックダウンさせ、動物実験および病理組織標本を作製する計画であり、それらの費用に充てる予定である。
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