| 研究課題/領域番号 |
21K08674
|
|---|
| 研究機関 | 九州大学 |
|---|
研究代表者 |
近藤 琢也 九州大学, 大学病院, 助教 (00644725)
|
|---|
| 研究分担者 |
永田 公二 九州大学, 大学病院, 講師 (20419568)
桐野 浩輔 九州大学, 大学病院, 助教 (00621707)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
|
| キーワード | ゼブラフィッシュ / 横隔膜ヘルニア / MMIHS / microinjection |
|---|
| 研究実績の概要 |
横隔膜に欠損孔を形成する疾患である横隔膜ヘルニアの欠損孔発生の機序や筋の発生機所を探るべく、筋肉の先天的欠損もしくは発生異常を伴うゼブラフィッシュモデルを作成し、評価することで、筋肉の発生機序に関する分子メカニズムをin vivoで解明し、最適な疾患モデルを開発し、最終的には新たな薬剤プラットフォームを作成する事を目標とした。
ゼブラフィッシュを用いた実験を開始するにあたり、実際に実験動物として飼育している、九州大学の他研究室を訪問・見学し、まずは必要な飼育設備の確認や飼育条件などの情報を収集した。それをもとに、飼育設備（複数個の水槽や恒温器、タイマー、照明器具、ふ化した幼魚の隔離設備など）の準備進めたうえで、当大学の実験動物（魚類）の飼育に関する申請を行い、認可を得た。
同時に、ゼブラフィッシュへの遺伝子導入手法として利用予定のmicroinjection法に関しても、同一の研究室で産卵した卵にどのようにmicroinjectionを行っているのか、実験の様子を見学して方法を学び、遺伝子導入に必要な機材も準備した。
骨格筋形成不全モデル作成では、CDHの原因遺伝子として、gata6, gata4, disp1, myh10, zfpm2,dsel, hlx, nr2r2をターゲットとし、平滑筋形成不全モデル作成では、腸管機能不全の一つであるMMIHSの原因遺伝子として、ACTG2、LMOD1をターゲットとした。これらのknock outモデルを作成したうえで、骨格筋/平滑筋の発生や機能評価を行う予定である。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
実験動物としてのゼブラフィッシュの使用は初めてであったため、他研究室の見学を行った。コロナの影響により日程調整に難渋したが、ゼブラフィッシュの飼育設備に関するアドバイスを受け、飼育条件に関しても指導いただいた。設備の準備は順調であったが、温度管理を厳格に行うための環境整備に時間を要した。また、昨今の動物実験に関する法の順守のため、当科の研究設備を整えたのちにまずは飼育許可の申請を行った。引き続き、遺伝子改変実験の申請、動物実験の申請を行ったが、これらに複数回の修正が必要だったため、同じく時間を要することとなった。進捗として実験動物飼育の開始が遅れる結果となった。
|
| 今後の研究の推進方策 |
2022年度よりゼブラフィッシュ飼育を開始し、飼育設備の不備や改良点を確認しつつ、飼育条件の確認・調整を開始する予定である。適切な親魚の飼育条件を整えたのちに、安定的な繁殖が可能な状態を整える。その後、卵の回収を行い遺伝子導入の手技獲得を進める。
microinjection法を使用した遺伝子導入を予定しているが、実際の実験手技に関しては、すでに他研究室の見学を済ませており、その方法と同様の方法で遺伝子導入手技獲得を進める予定である。手技確立とともに、CDHの原因遺伝子（gata6, gata4, disp1, myh10, zfpm2,dsel, hlx, nr2r2）とMMIHSの原因遺伝子（ACTG2、LMOD1）のloss-of-function mutantモデルやknock outモデル作成を目指す。遺伝子改変モデルにおいては、遺伝子導入の確認より始め、まずは生存ふ化率や成長の状況を評価する。引き続いて、魚類の標本作成手技の確立も併せて進め、標本作成手技安定化後に病理学的評価を開始する予定としている。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
ゼブラフィッシュの飼育環境整備に時間を要した。また、遺伝子改変実験の申請、動物実験の申請を行ったが、これらに複数回の修正が必要だったため、同じく時間を要することとなった。以上より、進捗として実験動物飼育の開始が遅れる結果となったため。
使用計画：ゼブラフィッシュ飼育に伴う消耗品、抗体、試薬
|
