| 研究課題/領域番号 |
21K08746
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| 研究機関 | 弘前大学 |
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研究代表者 |
袴田 健一 弘前大学, 医学研究科, 教授 (30271802)
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| 研究分担者 |
石戸 圭之輔 弘前大学, 医学研究科, 准教授 (00436023)
三浦 卓也 弘前大学, 医学部附属病院, 講師 (30722136)
脇屋 太一 弘前大学, 医学部附属病院, 講師 (50571246)
木村 憲央 弘前大学, 医学研究科, 講師 (60436029)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | リキッドバイオプシー / Kras変異遺伝子 / cfDNA / CA19-9 / プロテオミクス |
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| 研究実績の概要 |
全身病としての膵癌の予後向上には、新たな抗腫瘍薬の開発とともに、治療を適時、適正に行うために、Liquid biopsyの開発が必要である。本研究では、新規ゲノム解析法を駆使して、「新たな微小膵癌の検出法の開発」と「遊離膵癌細胞のゲノム発現調節機構の解明」に取り組むことを目的としている。本年度は、昨年度に引き続きKras遺伝子変異の新たな検出法の開発に加え、プロテオミクス法により膵癌細胞の生物学的悪性度や遠隔転移との相関が指摘されているCA19-9値の変動に関係するタンパクの検出を行った。Kras遺伝子変異の検出については、KRAS G12Dに加えKRAS G12C、KRAS G12VについてcfDNA濃度を調整してサンプル検体を作成し、複数の増幅検査法で検出感度の検証を実施したのち、血漿中cfDNA濃度を調整してPCR測定の指摘条件を検証した。現在は、膵癌患者の化学療法前後の血漿を用いてKras遺伝子変異の測定、さらに切除標本でKRAS変異を確認し、KRAS変異検出によるLiquid biopsyの腫瘍動態解析の意義を継続検討している。一方、「遊離膵癌細胞のゲノム発現調節機構の解明」については、術前のCA19-9値別に手術で切除した膵癌組織中のプロテオミクス解析で、全1060のタンパクを同定し、うち358のタンパクがCA19-9値と連動していた。いずれも、解糖系酵素を含むエネルギー代謝に関係するタンパクであり、CA19-9高値は代謝経路のリプログラミングを表現している可能性が示唆された。結果は J Gastroenterol 2022;57:798-811（doi: 10.1007/s00535-022-01898-0.）に報告した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
「新たな微小膵癌の検出法の開発」については、膵癌の95%以上で変異を示すKras遺伝子を第一の標的とし、昨年度解析したKRAS G12Dに加えKRAS G12C、KRAS G12VについてもリアルタイムPCR反応系ならびにデジタルPCR反応系の最適条件の確立と検証を行なった。さらに、血漿内cfDNA抽出機器の選択、抽出法の最適条件について検討を行なった。ついで、進行膵癌患者の化学療法前後での採血検体と、手術で採取した膵癌組織をもとに、血中KRAS変異の検出が腫瘍の進展や化学療法への奏功を反映するLiquid biopsyとしての意義について、検証を開始した。一方、「遊離膵癌細胞のゲノム発現調節機構の解明」については、遊離癌細胞の捕捉の前の基礎実験として、膵癌患者128例をCA19-9高値、低値、正常例別に３群に分類し、それぞれの群別のプロテオミクス解析で、1060個のタンパクを同定し、うちNCBI GEO(Gene Expression Omnibus)からCA19-9に関係する分子は45個、さらにCA19-9高値と相関する10の分子を同定し、CA19-9高値症例では低酸素に依存しない解糖系の亢進がみられることを明らかにした。今後これらをもとに新たなバイオマーカーを評価する。また遊離膵癌細胞の捕捉法については今後検証する。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度は、細胞株由来複数のKRAS変異についてのリアルタイムPCR反応系ならびにデジタルPCR反応系の最適条件の確立、また、複数のKras変異遺伝子サンプルを濃度調整したcfDNAモデルで同様に検出可能かの検証を行なった。さらに、血漿内cfDNA抽出機器の選択、抽出法の最適条件について検討までを行うことができた。現在、進行膵癌患者の化学療法前後での採血検体と、手術で採取した膵癌組織をもとに、血中KRAS変異の検出が腫瘍の進展や化学療法への奏功を反映するLiquid biopsyとしての意義について検証中であり、来年度も継続する予定である。これらの研究に多くの時間を要したため、遊離膵癌細胞の捕捉法について検証を行は遅れている。cfDNAのKas変異遺伝子ならびにCA19-9関連遺伝子の同定に目処がたった段階で、進行膵癌患者の余剰血液を用いて遊離膵癌細胞検出感度の検討に移行する予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
新型コロナウイルス感染症流行の社会的影響により、試薬搬入が若干遅れ、KRAS変異の血中測定と膵癌組織測定の実験系が来年度に持ち越した。現在順調に進行しており、次年度までには予定通り使用する予定である。また、次年度に繰り越した流血中膵癌細胞検出の実験も併せて実施する予定である。
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